閔春艷， 游本剛， 許瓊明， 李笑然， 唐麗華， 楊世林

(1.蘇州藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215002;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州215213)

金銀花系忍冬科植物忍冬Lonicerae japonicae Thunb的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱之功效［1］。主要成分為有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)和皂苷類(lèi)等［2-3］，其中，木犀草苷是金銀花用以區(qū)別山銀花的特征性成分，也是其主要藥效成分之一。因此，在原有綠原酸質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，新增了木犀草苷作為2005年版、2010年版《中國(guó)藥典》金銀花質(zhì)量控制指標(biāo)［4-5］。多年以來(lái)，在金銀花藥材的提取工藝及提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，均是以綠原酸為質(zhì)控指標(biāo)，而木犀草苷卻未引起足夠的重視［6-7］。本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定金銀花提取物中綠原酸與木犀草苷的方法，同時(shí)以?xún)煞N成分為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化并比較了金銀花藥材的乙醇提取工藝。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(配備SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，LC-20AT型泵，CTO-10ASVP型溫控柱溫箱，LC solution型色譜工作站，日本島津儀器公司);AS20500AT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電子分析天平(賽多利斯)。

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110753-200413);木犀草苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，111720-200501);金銀花藥材(蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號(hào)071211-1);乙腈(色譜純，TEDIA公司);四氫呋喃(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 綠原酸和木犀草苷的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10.18 mg，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為203.6 μg/mL的綠原酸貯備液。

精密稱(chēng)取木犀草苷對(duì)照品10.06 mg，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為201.2 μg/mL的木犀草苷貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取金銀花提取物樣品約20 mg，置10 mL量瓶?jī)?nèi)，加入50%甲醇溶解、定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.3 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);以乙腈-四氫呋喃(95 ∶5)為流動(dòng)相 A，0.4% 磷酸為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫:0～8 min，88%B;8～10 min，80%B;10～25 min，80%B～75%B;綠原酸和木犀草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為327 nm和350 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫 35 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

分別取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，適當(dāng)稀釋后采用上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 金銀花供試液在350 nm(A)和327 nm(B)的液相色譜圖及對(duì)照品溶液在350 nm(C)和327 nm(D)的液相色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系 精密量取上述兩種貯備液適量，用50%甲醇稀釋?zhuān)謩e得質(zhì)量濃度為 10.18、20.36、40.72、81.44、122.16、162.88 μg/mL 的綠原酸系列對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為 2.012、4.024、8.048、12.072、16.096、20.12 μg/mL 的木犀草苷系列對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量濃度C對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，得綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A=58026C-120395(r=0.9999)，線性范圍為10.18 ～162.88 μg/mL;木犀草苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=55898C-49443(r=0.9997)，線性范圍為2.01 ～20.12 μg/mL。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，在一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，以及連續(xù)5 d進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得綠原酸和木犀草苷的日內(nèi)RSD分別為1.32%和1.79%，日間RSD分別為 1.74%和 2.33%。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知綠原酸和木犀草苷量的提取物樣品適量，置10 mL量瓶?jī)?nèi)，分別精密加入相當(dāng)于已知對(duì)照品量80%、100%、120%的綠原酸、木犀草苷對(duì)照品，加入50%甲醇溶解、搖勻，濾過(guò)。將續(xù)濾液適當(dāng)稀釋后HPLC進(jìn)樣測(cè)定綠原酸和木犀草苷的量，計(jì)算得綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為103.29%和102.18%，RSD分別為 1.21%和 1.99%。

2.2 乙醇回流提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的金銀花藥材50 g，加入一定量的乙醇，浸泡0.5 h后，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。藥材回流提取2次后，合并每次實(shí)驗(yàn)的金銀花提取液，過(guò)濾后減壓濃縮、真空干燥后進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)直觀分析(見(jiàn)表3)，影響因素順序?yàn)锳＞B＞C，即含乙醇量＞乙醇用量＞回流時(shí)間;最佳工藝為A1B1C1，即60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次0.5 h。方差分析結(jié)果表明3個(gè)因素對(duì)綠原酸的提取效果均無(wú)顯著性影響。

表3 綠原酸轉(zhuǎn)移率直觀分析

以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)直觀分析(見(jiàn)表4)，影響因素順序?yàn)镃＞A＞B，即回流時(shí)間＞含乙醇量＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1，即60%乙醇10倍量，回流提取2次，每次0.5 h。方差分析結(jié)果表明3個(gè)因素對(duì)木犀草苷的提取效果均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

為兼顧綠原酸和木犀草苷的提取效果，結(jié)合兩者的轉(zhuǎn)移率計(jì)算，總轉(zhuǎn)移率評(píng)分=綠原酸轉(zhuǎn)移率/最高值×50+木犀草苷轉(zhuǎn)移率/最高值×50，以總轉(zhuǎn)移率評(píng)分為指標(biāo)來(lái)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析(見(jiàn)表5)，則影響因素順序?yàn)镃＞A＞B，即回流時(shí)間＞含乙醇量＞乙醇用量;最佳工藝為A1B1C1，即60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次0.5h。方差分析結(jié)果表明3個(gè)因素對(duì)兩成分的總提取效果均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

表4 木犀草苷轉(zhuǎn)移率直觀分析

表5 總轉(zhuǎn)移率評(píng)分直觀分析

2.3 乙醇超聲提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的金銀花藥材50 g，加入一定量的乙醇，浸泡0.5 h后，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平表見(jiàn)表6。藥材提取后，合并每次實(shí)驗(yàn)的金銀花提取液，過(guò)濾后減壓濃縮、真空干燥后進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表7。

以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)直觀分析(見(jiàn)表8)，影響因素順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即含乙醇量＞超聲功率＞超聲時(shí)間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2，即60%乙醇12倍量，超聲功率240W，超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(xiàng)(C項(xiàng))為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明A、B、D 3個(gè)因素對(duì)綠原酸的提取效果均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

表6 因素水平表

表7 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)直觀分析(見(jiàn)表9)，影響因素順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即超聲功率＞含乙醇量＞超聲時(shí)間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1D2，即60%乙醇8倍量，超聲功率240W，超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(xiàng)(C項(xiàng))為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明A、B、D 3個(gè)因素對(duì)木犀草苷的提取效果均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

表8 綠原酸轉(zhuǎn)移率直觀分析

表9 木犀草苷轉(zhuǎn)移率直觀分析

以總轉(zhuǎn)移率評(píng)分為指標(biāo)直觀分析(見(jiàn)表10)，影響因素順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即含乙醇量＞超聲功率＞超聲時(shí)間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2，即60%乙醇12倍量，超聲功率240 W，超聲1.0 h。以離差平方和最小的因素項(xiàng)(C項(xiàng))為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明A、B、D 3個(gè)因素對(duì)兩者的總提取效果均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

表10 總轉(zhuǎn)移率評(píng)分直觀分析

2.4 不同工藝的比較 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的金銀花藥材50 g，按上述兩種提取方法的最佳工藝進(jìn)行提取，制備樣品并進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 幾種最佳工藝提取效果的比較(n=3)

由上表可見(jiàn)，以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，乙醇回流法顯著優(yōu)于超聲法;若以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，則超聲法略?xún)?yōu)于回流法。同一提取方法，評(píng)價(jià)指標(biāo)不同，得到的最佳工藝也有差異，對(duì)兩種成分的提取效果略有不同。但以總轉(zhuǎn)移率評(píng)分為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果與以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)一致。

3 討論

本研究建立的HPLC方法可用于金銀花中綠原酸和木犀草苷的同時(shí)測(cè)定，且含量均符合《中國(guó)藥典》的要求，是對(duì)《中國(guó)藥典》方法的一個(gè)補(bǔ)充。

木犀草苷是金銀花用以區(qū)別山銀花的特征性成分，具有很強(qiáng)的抗呼吸道合胞體病毒活性，也是其抗菌抗病毒有效成分之一［8］。因此，在金銀花的提取工藝研究中，不能僅以單一成分為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，否則不能反映兩種甚至多種成分的綜合提取效果，應(yīng)結(jié)合藥理學(xué)研究結(jié)果，選擇合理的指標(biāo)性成分，才能充分保證提取工藝的可行性和提取物的藥效［9-10］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，回流法顯著優(yōu)于超聲法;以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，則超聲法略?xún)?yōu)于煎煮法。綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果與以綠原酸為指標(biāo)一致，可能與木犀草苷的提取轉(zhuǎn)移率偏低，對(duì)總轉(zhuǎn)移率評(píng)分的貢獻(xiàn)相對(duì)較小有關(guān)。另外，本研究中測(cè)定的是固體提取物中有效成分的轉(zhuǎn)移率，木犀草苷的轉(zhuǎn)移率偏低且遠(yuǎn)低于在提取液中的轉(zhuǎn)移率，可能與其濃縮干燥過(guò)程中的穩(wěn)定性有關(guān)。如何增加木犀草苷的提取率及改善其穩(wěn)定性，充分保證金銀花提取物的質(zhì)量，還有待進(jìn)一步研究。

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