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        木香馬兜鈴與七味紅花殊勝丸中馬兜鈴酸A測(cè)定研究

        2011-07-25 10:27:32魏玉海王慧春劉亞蓉劉海青韓曉萍
        中成藥 2011年12期
        關(guān)鍵詞:馬兜鈴木香紅花

        魏玉海, 王慧春, 劉亞蓉, 劉海青, 韓曉萍, 宋 霞

        (青海省藥品檢驗(yàn)所,青海西寧810016)

        七味紅花殊勝丸為藏醫(yī)傳統(tǒng)名方,藏文名“苦空確屯日布”,由紅花、天竺黃、獐牙菜、訶子、麻黃、木香馬兜鈴、五脈綠絨蒿七味藏藥材組成。具有清熱消炎、保肝退黃。用于新舊肝病,勞傷引起的肝血增盛,肝腫大,鞏膜黃染,食欲不振[1-2]。木香馬兜鈴為馬兜鈴科植物木香馬兜鈴Aristolochia moupinensis Franch.的干燥莖及根莖[3-5]。陳婭娟等[6]、周娜等[7]、姚冬琴等[8]均分別報(bào)道了馬兜鈴酸A的腎毒性及其機(jī)制,因此有必要對(duì)含馬兜鈴酸A的木香馬兜鈴及其制劑七味紅花殊勝丸中的馬兜鈴酸A量進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定七味紅花殊勝丸及木香馬兜鈴中馬兜鈴酸A的測(cè)定方法,該方法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定木香馬兜鈴與七味紅花殊勝丸中馬兜鈴酸A。

        1 儀器與試藥

        Waters2695型高效液相色譜儀,Waters2998二極管陣列檢測(cè)器,Empower化學(xué)工作站(美國(guó)Waters公司);電子天平(METTLER AB204-S,瑞士 METTLER公司);電子天平(METTLER TOLEDO,瑞士METTLER公司);超聲波清洗器(B2500s-MT,上海必能信超聲波清洗儀有限公司)。

        馬兜鈴酸A對(duì)照品(110746-200204)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈均為色譜純,其余試劑為分析純,水為超純水。七味紅花殊勝丸樣品、木香馬兜及處方中相應(yīng)藥材由兩家不同藥廠提供,5批七味紅花殊勝丸批號(hào)分別為:06343A、09177A、090401、090701、100501。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 Sunfire-ODS C18柱(5 μm,250 mm × 4.6 mm);柱溫30℃室溫;流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液(45∶55)(按此比例混合后pH大于3);體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。

        2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取馬兜鈴酸A對(duì)照品7.40 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,取2 mL置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度搖勻,即得,馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為14.8 μg/mL。

        2.3 供試品溶液的制備

        2.3.1 七味紅花殊勝丸供試品溶液制備 取本品中粉約1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,搖勻,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)40 min,取出,過(guò)濾,同時(shí)用少量70%甲醇沖洗藥渣,并入濾液,濾液蒸干,殘?jiān)?5 mL水使溶解,水液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH值至1,用三氯甲烷萃取4次(每次20 mL),合并三氯甲烷,蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.3.2 木香馬兜鈴供試品溶液制備 取本品中粉約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,搖勻,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)40 min,取出,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取除去木香馬兜鈴藥材的其他藥材適量,依照上述供試品溶液的制備方法,制成陰性對(duì)照溶液。

        2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在上述色譜條件下,精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀。供試品色譜圖中,在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間上,有相同的色譜峰,而陰性對(duì)照在此無(wú)干擾,陰性色譜圖見(jiàn)圖1。

        2.6 馬兜鈴酸A峰的證明 為進(jìn)一步證明供試品中所檢測(cè)的色譜峰為馬兜鈴酸A的色譜峰,在提取色譜峰的同時(shí),用二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)進(jìn)行了光譜掃描,結(jié)果對(duì)照品與供試品相同的保留時(shí)間主峰的最大吸收分別均為:225、249、322、394 nm,而在與對(duì)照品與供試品相同保留時(shí)間的主峰處及前后均無(wú)相應(yīng)光譜圖,證明了樣品中所測(cè)得主峰為馬兜鈴酸A的峰。

        圖1 陰性對(duì)照、對(duì)照品、樣品HPLC色譜圖

        2.7 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件,分別將上述馬兜鈴酸 A 對(duì)照品溶液(14.8 μg/mL),稀釋成 0.74、2.96、5.92、8.88、11.84、14.8 μg/mL 的溶液,分別精密吸取各對(duì)照品溶液20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)得峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),馬兜鈴酸A對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得回歸方程:Y=5.02×106×X -368×10,r=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果表明在 0.0148 μg ~0.294 μg 的范圍內(nèi),馬兜鈴酸A進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

        2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液(14.8 μg/mL),連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣體積為10 μL,測(cè)得馬兜鈴酸A峰面積RSD為0.26%。結(jié)果表明精密度良好。

        2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為06343A的七味紅花殊勝丸樣品,按供試品制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液,按上述色譜條件分別于 0,2,4,6,8,12 h 注入液相色譜儀,每次進(jìn)樣體積為10 μL,測(cè)定峰面積,按馬兜鈴酸 A峰面積計(jì)算RSD為1.2%(n=6)。結(jié)果表明:供試品中馬兜鈴酸A在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為06343A的七味紅花殊勝丸樣品5份,按供試品制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液,每份樣品進(jìn)2針,每次進(jìn)樣體積為10 μL,在上述色譜條件下,測(cè)定馬兜鈴酸A,按馬兜鈴酸A峰面積計(jì)算RSD為1.1%(n=6)。結(jié)果表明供試品重現(xiàn)性良好。

        2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知馬兜鈴酸A量樣品(批號(hào)06343A,0.3848 mg/g)0.5 g,精密稱(chēng)定共 9 份,平均分為 3組,依次加入馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液(0.074 mg/mL)2 mL、2.5 mL、3 mL,按供試品溶液方法制成所需溶液。依法測(cè)定,計(jì)算收率。結(jié)果見(jiàn)表1,回收率為98.9%,RSD為1.0%。

        表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

        2.12 樣品測(cè)定 分別取七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴藥材,按照上述2.3項(xiàng)下七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴供試品溶液的制備方法,分別制備七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴的供試品溶液,并按上述2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得兩批次木香馬兜鈴藥材(樣品1、樣品2)及5批次七味紅花殊勝丸(06343A、09177A、090401、090701、100501)中馬兜鈴酸A量結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 木香馬兜鈴與七味紅花殊勝丸中馬兜鈴酸A

        3 討論

        3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以二極管陣列檢測(cè)器對(duì)馬兜鈴酸A(質(zhì)量濃度為0.0148 mg/mL)在200~400 nm進(jìn)行紫外掃描,在225、249、322、394 nm處分別均有最大吸收,通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)225 nm處為末端吸收,因此在色譜圖上反應(yīng)出雜質(zhì)峰面積較高,在394 nm長(zhǎng)波長(zhǎng)處,選擇394 nm的為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)測(cè)得馬兜鈴酸A主峰面積有所降低,參考文獻(xiàn)[9-10]及實(shí)際測(cè)得色譜峰情況,認(rèn)為在選擇322 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)為最適條件,不過(guò)以225、249、394 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)也可以進(jìn)行測(cè)定。

        3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇0.05%磷酸溶液,結(jié)果用乙腈 -0.05%磷酸溶液(45 ∶55)時(shí)的分離效果良好[11-13],0.05%磷酸溶液pH約為2.5,當(dāng)與乙腈按上述比例混合后,pH大于3,對(duì)普通色譜柱有較好耐用性。

        3.3 供試品提取方式的選擇 在供試品的提取過(guò)程中選擇了回流、超聲、索氏提取的方法,結(jié)果對(duì)于七味紅花殊勝丸供試品溶液制備在超聲處理后,用三氯甲烷從酸水液中提取,所得樣品回收率高,且雜質(zhì)無(wú)干擾[11-14];對(duì)于木香馬兜鈴供試品溶液制備經(jīng)過(guò)超聲處理便可進(jìn)樣,分離良好,雜質(zhì)峰無(wú)干擾。

        3.4 5批次七味紅花殊勝丸馬兜鈴酸A的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%,兩批木香馬兜鈴藥材中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.13%。譚睿等測(cè)得二十五味松石膠囊中馬兜鈴酸A平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03 μg/g[9],陳燕等測(cè)得二十五味綠絨蒿丸中馬兜鈴酸 A平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.11 mg/丸[10]。英錫相等[15]、周躍華等[16]、韓娜等[17]、劉麗芳等[18]等均測(cè)定了部分含馬兜鈴酸A 的藥材及成藥,而譚睿等[9]、陳燕等[10]測(cè)定了含木香馬兜鈴藥材成藥中的馬兜鈴酸A,但均未見(jiàn)直接測(cè)定木香馬兜鈴藥材中馬兜鈴酸A的報(bào)道?!吨袊?guó)藥典》2010年版一部細(xì)辛中所含馬兜鈴酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度為不得過(guò)0.001%[11],我們所測(cè)成藥與藥材中的馬兜鈴酸A均高于此限度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的部分含木香馬兜鈴的藏成藥中馬兜鈴酸A的含量比較高,考慮到馬兜鈴酸A的腎毒性,在臨床使用含木香馬兜鈴藥材成藥過(guò)程中,長(zhǎng)期服用或不同年齡階段的患者要慎重服用,對(duì)于藏成藥中馬兜鈴酸A的含有量較高的,考慮替換處方中木香馬兜鈴藥材。

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