魏玉海， 王慧春， 劉亞蓉， 劉海青， 韓曉萍， 宋 霞

(青海省藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016)

七味紅花殊勝丸為藏醫(yī)傳統(tǒng)名方，藏文名“苦空確屯日布”，由紅花、天竺黃、獐牙菜、訶子、麻黃、木香馬兜鈴、五脈綠絨蒿七味藏藥材組成。具有清熱消炎、保肝退黃。用于新舊肝病，勞傷引起的肝血增盛，肝腫大，鞏膜黃染，食欲不振［1-2］。木香馬兜鈴為馬兜鈴科植物木香馬兜鈴Aristolochia moupinensis Franch.的干燥莖及根莖［3-5］。陳婭娟等［6］、周娜等［7］、姚冬琴等［8］均分別報(bào)道了馬兜鈴酸A的腎毒性及其機(jī)制，因此有必要對(duì)含馬兜鈴酸A的木香馬兜鈴及其制劑七味紅花殊勝丸中的馬兜鈴酸A量進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定七味紅花殊勝丸及木香馬兜鈴中馬兜鈴酸A的測(cè)定方法，該方法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定木香馬兜鈴與七味紅花殊勝丸中馬兜鈴酸A。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站(美國(guó)Waters公司);電子天平(METTLER AB204-S，瑞士 METTLER公司);電子天平(METTLER TOLEDO，瑞士METTLER公司);超聲波清洗器(B2500s-MT，上海必能信超聲波清洗儀有限公司)。

馬兜鈴酸A對(duì)照品(110746-200204)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。七味紅花殊勝丸樣品、木香馬兜及處方中相應(yīng)藥材由兩家不同藥廠提供，5批七味紅花殊勝丸批號(hào)分別為:06343A、09177A、090401、090701、100501。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Sunfire-ODS C18柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm);柱溫30℃室溫;流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液(45∶55)(按此比例混合后pH大于3);體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取馬兜鈴酸A對(duì)照品7.40 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得，馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為14.8 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 七味紅花殊勝丸供試品溶液制備 取本品中粉約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，搖勻，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，取出，過(guò)濾，同時(shí)用少量70%甲醇沖洗藥渣，并入濾液，濾液蒸干，殘?jiān)?5 mL水使溶解，水液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH值至1，用三氯甲烷萃取4次(每次20 mL)，合并三氯甲烷，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 木香馬兜鈴供試品溶液制備 取本品中粉約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，搖勻，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，取出，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取除去木香馬兜鈴藥材的其他藥材適量，依照上述供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀。供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間上，有相同的色譜峰，而陰性對(duì)照在此無(wú)干擾，陰性色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 馬兜鈴酸A峰的證明 為進(jìn)一步證明供試品中所檢測(cè)的色譜峰為馬兜鈴酸A的色譜峰，在提取色譜峰的同時(shí)，用二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)進(jìn)行了光譜掃描，結(jié)果對(duì)照品與供試品相同的保留時(shí)間主峰的最大吸收分別均為:225、249、322、394 nm，而在與對(duì)照品與供試品相同保留時(shí)間的主峰處及前后均無(wú)相應(yīng)光譜圖，證明了樣品中所測(cè)得主峰為馬兜鈴酸A的峰。

圖1 陰性對(duì)照、對(duì)照品、樣品HPLC色譜圖

2.7 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件，分別將上述馬兜鈴酸 A 對(duì)照品溶液(14.8 μg/mL)，稀釋成 0.74、2.96、5.92、8.88、11.84、14.8 μg/mL 的溶液，分別精密吸取各對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，馬兜鈴酸A對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:Y=5.02×106×X -368×10，r=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果表明在 0.0148 μg ～0.294 μg 的范圍內(nèi)，馬兜鈴酸A進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液(14.8 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣體積為10 μL，測(cè)得馬兜鈴酸A峰面積RSD為0.26%。結(jié)果表明精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為06343A的七味紅花殊勝丸樣品，按供試品制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按上述色譜條件分別于 0，2，4，6，8，12 h 注入液相色譜儀，每次進(jìn)樣體積為10 μL，測(cè)定峰面積，按馬兜鈴酸 A峰面積計(jì)算RSD為1.2%(n=6)。結(jié)果表明:供試品中馬兜鈴酸A在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為06343A的七味紅花殊勝丸樣品5份，按供試品制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，每份樣品進(jìn)2針，每次進(jìn)樣體積為10 μL，在上述色譜條件下，測(cè)定馬兜鈴酸A，按馬兜鈴酸A峰面積計(jì)算RSD為1.1%(n=6)。結(jié)果表明供試品重現(xiàn)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知馬兜鈴酸A量樣品(批號(hào)06343A，0.3848 mg/g)0.5 g，精密稱(chēng)定共 9 份，平均分為 3組，依次加入馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液(0.074 mg/mL)2 mL、2.5 mL、3 mL，按供試品溶液方法制成所需溶液。依法測(cè)定，計(jì)算收率。結(jié)果見(jiàn)表1，回收率為98.9%，RSD為1.0%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.12 樣品測(cè)定 分別取七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴藥材，按照上述2.3項(xiàng)下七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴供試品溶液的制備方法，分別制備七味紅花殊勝丸與木香馬兜鈴的供試品溶液，并按上述2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得兩批次木香馬兜鈴藥材(樣品1、樣品2)及5批次七味紅花殊勝丸(06343A、09177A、090401、090701、100501)中馬兜鈴酸A量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 木香馬兜鈴與七味紅花殊勝丸中馬兜鈴酸A

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以二極管陣列檢測(cè)器對(duì)馬兜鈴酸A(質(zhì)量濃度為0.0148 mg/mL)在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，在225、249、322、394 nm處分別均有最大吸收，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)225 nm處為末端吸收，因此在色譜圖上反應(yīng)出雜質(zhì)峰面積較高，在394 nm長(zhǎng)波長(zhǎng)處，選擇394 nm的為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)測(cè)得馬兜鈴酸A主峰面積有所降低，參考文獻(xiàn)［9-10］及實(shí)際測(cè)得色譜峰情況，認(rèn)為在選擇322 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)為最適條件，不過(guò)以225、249、394 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)也可以進(jìn)行測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇0.05%磷酸溶液，結(jié)果用乙腈 -0.05%磷酸溶液(45 ∶55)時(shí)的分離效果良好［11-13］，0.05%磷酸溶液pH約為2.5，當(dāng)與乙腈按上述比例混合后，pH大于3，對(duì)普通色譜柱有較好耐用性。

3.3 供試品提取方式的選擇 在供試品的提取過(guò)程中選擇了回流、超聲、索氏提取的方法，結(jié)果對(duì)于七味紅花殊勝丸供試品溶液制備在超聲處理后，用三氯甲烷從酸水液中提取，所得樣品回收率高，且雜質(zhì)無(wú)干擾［11-14］;對(duì)于木香馬兜鈴供試品溶液制備經(jīng)過(guò)超聲處理便可進(jìn)樣，分離良好，雜質(zhì)峰無(wú)干擾。

3.4 5批次七味紅花殊勝丸馬兜鈴酸A的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%，兩批木香馬兜鈴藥材中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.13%。譚睿等測(cè)得二十五味松石膠囊中馬兜鈴酸A平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03 μg/g［9］，陳燕等測(cè)得二十五味綠絨蒿丸中馬兜鈴酸 A平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.11 mg/丸［10］。英錫相等［15］、周躍華等［16］、韓娜等［17］、劉麗芳等［18］等均測(cè)定了部分含馬兜鈴酸A 的藥材及成藥，而譚睿等［9］、陳燕等［10］測(cè)定了含木香馬兜鈴藥材成藥中的馬兜鈴酸A，但均未見(jiàn)直接測(cè)定木香馬兜鈴藥材中馬兜鈴酸A的報(bào)道?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部細(xì)辛中所含馬兜鈴酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度為不得過(guò)0.001%［11］，我們所測(cè)成藥與藥材中的馬兜鈴酸A均高于此限度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的部分含木香馬兜鈴的藏成藥中馬兜鈴酸A的含量比較高，考慮到馬兜鈴酸A的腎毒性，在臨床使用含木香馬兜鈴藥材成藥過(guò)程中，長(zhǎng)期服用或不同年齡階段的患者要慎重服用，對(duì)于藏成藥中馬兜鈴酸A的含有量較高的，考慮替換處方中木香馬兜鈴藥材。

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