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        響應(yīng)面分析法優(yōu)化川芎藁本內(nèi)酯提取工藝的研究

        2011-07-25 10:27:32朱家校
        中成藥 2011年12期
        關(guān)鍵詞:藁本川芎內(nèi)酯

        朱家校, 何 偉, 李 勇, 姚 曦

        (廣東藥學(xué)院藥物研究所廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510006)

        川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性溫,味辛、微苦,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效。主治血瘀氣滯所致月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉,肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等疾?。?]。川芎主要成分是藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸等[2-4],具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制脂質(zhì)過氧化、抗血栓、抗心肌缺血、舒張血管、抑制神經(jīng)元變性等藥理作用[5-10]。

        響應(yīng)面分析法(Response Surface Methology,RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的方法,1951年Box和Wilsond首次用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應(yīng)值的影響[11]。在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中,響應(yīng)面分析法可以連續(xù)地對實(shí)驗(yàn)的各個水平進(jìn)行分析,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法,以藁本內(nèi)酯量為指標(biāo)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察川芎回流提取,提取溫度、含乙醇量、提取時間3個因素對提取效果的影響,優(yōu)選川芎藁本內(nèi)酯的最佳提取工藝。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測器、Chromeleon色譜工作站);BS224S型電子分析天平(北京sartorius);HWS-12電熱恒溫水浴鍋(普瑞賽斯儀器有限公司)。

        1.2 試藥 川芎藥材(批號:080401)購自廣州致信中藥飲片有限公司;藁本內(nèi)酯對照品(批號:0817-9502,供定量測定用)購自天津一方科技有限公司;試劑:甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 藁本內(nèi)酯測定

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相∶甲醇-水(77 ∶23);檢測波長:324 nm;柱溫:30 ℃;體積流量:1.0 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按藁本內(nèi)酯計(jì)不應(yīng)低于5000。

        2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取川芎藥材粗粉10.0 g,平行2份,置圓底燒瓶中,準(zhǔn)確加入一定量和一定濃度的乙醇,回流提取2次,每次一定時間,濾過,合并濾液,定容,搖勻,精密吸取5 mL,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

        2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取藁本內(nèi)酯對照品20 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、3、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀中,測定藁本內(nèi)酯色譜峰面積,以藁本內(nèi)酯微克數(shù)為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),得回歸方程為:Y=41.298 X-0.1269,r=0.9999。表明藁本內(nèi)酯在 0.1600 μg ~1.600 μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

        2.1.4 定量測定 精密吸取供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀中,測定藁本內(nèi)酯色譜峰面積,計(jì)算藁本內(nèi)酯量。

        2.2 單因素試驗(yàn)確定主要影響因素及范圍

        2.2.1 提取溶劑的影響 固定提取溫度為80℃,提取時間為2.0 h,料液比為1∶25,分別以水、甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑,加熱回流提取,以觀察不同溶劑對藁本內(nèi)酯提取效果的影響(見圖1,n=3)。從圖1結(jié)果可以看出,當(dāng)用甲醇或乙醇作為提取溶劑時,藁本內(nèi)酯的提取量較高。由于甲醇具有一定的毒性,故選用乙醇作為提取溶劑。

        2.2.2 提取溫度的影響 固定提取時間為2.0 h,料液比為1∶25,含乙醇量為70%,改變提取溫度,以觀察其對藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見圖2-A,n=3)。從圖2-A結(jié)果可以看出,在一定溫度范圍內(nèi),隨提取溫度的升高,藁本內(nèi)酯的提取量逐漸增加。當(dāng)提取溫度超過80℃時,藁本內(nèi)酯提取量變化不明顯。因此,將響應(yīng)面試驗(yàn)中的提取溫度設(shè)定在70℃ ~90℃之間。

        圖1 不同提取溶劑對藁本內(nèi)酯提取量的影響

        2.2.3 提取時間的影響 固定提取溫度為80℃,料液比為1∶25,含乙醇量為70%,改變提取時間,以觀察其對藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見圖2-B,n=3)。從圖2-B結(jié)果可以看出,提取時間過短,藁本內(nèi)酯提取不完全;提取時間超過2 h后,藁本內(nèi)酯提取量的變化不明顯。因此,將響應(yīng)面試驗(yàn)中的提取時間設(shè)定在1.5~2.5 h之間。

        2.2.4 含乙醇量的影響 固定提取時間為2.0 h,提取溫度為80℃,料液比為1∶25,改變含乙醇量,以觀察其對藁本內(nèi)酯提取效果的影響(見圖2-C,n=3)。從圖2-C結(jié)果可以看出,含乙醇量升高,藁本內(nèi)酯提取量逐漸增加,70%乙醇提取量最高,但當(dāng)含乙醇量繼續(xù)增大時,藁本內(nèi)酯提取量明顯減少。因此,將響應(yīng)面試驗(yàn)中的含乙醇量設(shè)定在50% ~90%之間。

        圖2 不同試驗(yàn)因素對藁本內(nèi)酯提取量的影響

        2.2.5 料液比的影響 固定提取時間為2.0 h,提取溫度為80℃,含乙醇量為70%,改變料液比,以觀察其對藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見圖2-D,n=3)。從圖2-D可以看出,料液比為1∶25時,藁本內(nèi)酯提取量最高,料液比對藁本內(nèi)酯提取效果的影響程度比其他因素要小,為了減少實(shí)驗(yàn)次數(shù),所以提取工藝中料液比固定為1∶25。

        2.3 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件

        2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取進(jìn)取溫度、含乙醇量和提取時間3個對藁本內(nèi)酯提取量影響較大的因素,進(jìn)行3因素3水平(共15個試驗(yàn)點(diǎn),3個中心點(diǎn))的響應(yīng)面試驗(yàn),應(yīng)用Design-Expert7.16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,確定川芎中藁本內(nèi)酯的最佳提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1、2。

        2.3.2 模型擬合與顯著性檢驗(yàn) 將所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert7.16軟件對表2中進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合回歸,得到以藁本內(nèi)酯提取量(Y)為響應(yīng)值,3個參數(shù)為自變量的二次回歸模型方程為:

        表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

        為檢驗(yàn)方程的有效性,對川芎藁本內(nèi)酯提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,由表3可知,模型的P值小于0.01,表明二次方程擬合高度顯著,失擬項(xiàng)F值為12.02,顯示失擬項(xiàng)相對絕對誤差不顯著,而不顯著的失擬項(xiàng)才合理。提取溫度及提取時間對藁本內(nèi)酯的提取量有顯著影響;二次項(xiàng)X22影響極顯著;交互項(xiàng)按影響大小排序依次為X1X2、X2X3、X1X3。由圖3可知,隨含乙醇量的增加,藁本內(nèi)酯的提取量先升高后降低,說明藁本內(nèi)酯具有一定的極性;提取時間的延長,藁本內(nèi)酯的提取量先升高后降低,藁本內(nèi)酯在較高溫度的條件下不穩(wěn)定。剔除不顯著項(xiàng)后即得回歸方程式(2)。簡化的方程R=0.9608,降幅較小,說明此方程的可信度高。

        表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        表3 川芎藁本內(nèi)酯提取回歸模型方差分析

        2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸模型預(yù)測的川芎藁本內(nèi)酯提取的最佳工藝條件為:提取溫度88.87℃,含乙醇量70.72%,提取時間2.3 h,料液比1 ∶25,提取2 次,預(yù)測值為6.8696 mg/g??紤]到實(shí)際操作的可行性,將川芎藁本內(nèi)酯提取的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為:提取溫度 89℃,含乙醇量71%,提取時間2.3 h,料液比1∶25,提取2次,采用此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3),藁本內(nèi)酯提取量分別為 6.84,6.83,6.83mg/g,均與預(yù)測值相差不大,說明本實(shí)驗(yàn)所建模型得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

        圖3 各因素兩兩交互作用對藁本內(nèi)酯提取量影響的響應(yīng)面圖

        3 討論

        傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)[12],尋求最佳的因素水平組合,即用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合,試驗(yàn)次數(shù)雖少,但不能在設(shè)定的整個區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個明確的函數(shù)表達(dá)式,從而無法找到整個區(qū)域上的因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法克服了正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的缺陷,通過采用非線性擬合的中心組合-效應(yīng)面法研究各因素間相互作用的一種回歸分析方法。響應(yīng)面分析法亦有其局限性:設(shè)計(jì)的試驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳的實(shí)驗(yàn)條件,如果實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的選取不當(dāng),應(yīng)用響應(yīng)面分析法也不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果。因此,本實(shí)驗(yàn)首先以單因素試驗(yàn)確定主要影響因素及范圍,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面分析法考察藥材的提取溫度、含乙醇量、提取時間3個因素對提取效果的影響,優(yōu)選藁本內(nèi)酯的最佳提取工藝,有效地改善了提取效果,具有較大的實(shí)用價值。

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