陸少燕，宗素進(jìn)，杜苗苗，林 剛，杜季梅

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325027）

幽門(mén)螺桿菌（Helicobactor pylori，Hp）是人類(lèi)常見(jiàn)的致病菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍等多種消化道疾病的重要致病因素之一，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，1994年國(guó)際癌癥組織將其確定為I類(lèi)致癌原。

蜂膠（propolis）是蜜蜂從植物幼芽與樹(shù)干上采集的樹(shù)膠與其上顎腺分泌物和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠成分復(fù)雜，已知成分包括多酚類(lèi)（黃酮、酚酸及其酯類(lèi)）、萜類(lèi)、甾類(lèi)、氨基酸及揮發(fā)性物質(zhì)，不僅在抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的生物活性［1］。中醫(yī)藥文獻(xiàn)記載，蜂膠具有潤(rùn)膚生肌、解毒殺菌、祛風(fēng)止痛之功效，在民間有服用蜂膠酒治療胃病的習(xí)慣。國(guó)內(nèi)外研究證明，蜂膠不僅對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒等有抑制和殺滅作用，還具有抗氧化、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用［2］。

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，作者選擇黑龍江純蜂膠，用95%乙醇溶解后，對(duì)Hp進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 原料與試劑

菌株：NCTC11637，由浙江大學(xué)嚴(yán)杰教授饋贈(zèng)；培養(yǎng)基：哥倫比亞培養(yǎng)基（CMO331），10%脫纖維綿羊血 （購(gòu)自杭州新銳生物工程有限公司）；純蜂膠：購(gòu)于黑龍江省牡丹江市小蜜蜂生物工程有限責(zé)任公司；溶劑：乙醇，分析純；其他：無(wú)菌蒸餾水、6號(hào)新華濾紙、游標(biāo)卡尺等。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式不銹鋼蒸汽滅菌器，艾奇小厭氧罐，電熱恒溫培養(yǎng)箱，雙人單面凈化工作臺(tái)。

2 方法

2.1 蜂膠紙片制備

稱(chēng)取純蜂膠100g，磨碎后溶于200mL95%乙醇中（稀釋度為1∶2），連續(xù)2倍倍比稀釋至1∶1024，得到不同濃度的蜂膠溶液。用打孔器將6號(hào)新華濾紙打成直徑為6mm的圓形紙片，121℃高壓蒸汽滅菌15～20min，烘干備用。每張濾紙片加不同濃度蜂膠溶液7μL，以95%乙醇作空白對(duì)照。37℃放置1h，制成含量不同的藥敏紙片，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 H.pylori固體培養(yǎng)基的配制

稱(chēng)取哥倫比亞瓊脂干粉19.5g，加入蒸餾水450mL，用121℃高壓蒸汽滅菌15～20min，待冷卻到50℃，加50mL脫纖維綿羊血，配成含10%纖維綿羊血的哥倫比亞培養(yǎng)基，傾倒于無(wú)菌培養(yǎng)皿。

2.3 菌液的制備

將H.pylori于厭氧罐中在37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)3天，用布氏肉湯將其洗脫配制成懸液，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌濃度，將其制備為108CFU／mL的布氏肉湯菌液。

2.4 抑菌試驗(yàn)

將108CFU／mL的布氏肉湯菌液接種到哥倫比亞血平板后，用鑷子小心將不同濃度藥敏紙片貼于平板上。每個(gè)平板貼三片，呈正三角形，每個(gè)濃度紙片共重復(fù)4次。置厭氧培養(yǎng)罐中，37℃培養(yǎng)72h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，記錄測(cè)量結(jié)果。

3 結(jié)果

不同濃度蜂膠紙片對(duì)幽門(mén)螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結(jié)果見(jiàn)表1。

4 討論

蜂膠含有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、內(nèi)酯、醛、酮、甾類(lèi)等化合物，同時(shí)為無(wú)毒、無(wú)刺激、無(wú)致癌性，并具有抗菌、抗病毒、免疫激、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)組織再生等作用，因此蜂膠享有“紫色黃金”美譽(yù)。咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是蜂膠中的主要活性成分［3］，它作為抗氧化藥物和癌預(yù)防藥物研究的明星分子，受到了人們極大關(guān)注。CAPE對(duì)胃的保護(hù)通過(guò)阻止幽門(mén)螺桿菌及其誘發(fā)的細(xì)胞因子Kappa B蛋白降解，而且CAPE能夠抑制由幽門(mén)螺桿菌誘發(fā)的細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子TNF－alpha及IL－8的生成，另外CAPE還可以阻斷幽門(mén)螺桿菌誘發(fā)的COX－2的表達(dá)。經(jīng)CAPE預(yù)處理的胃上皮細(xì)胞同樣能夠阻斷細(xì)胞因子和細(xì)胞分裂素誘發(fā)的 NF－kappaB和 AP－1的表達(dá)［4］。

表1 不同濃度蜂膠紙片對(duì)幽門(mén)螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結(jié)果（）

表1 不同濃度蜂膠紙片對(duì)幽門(mén)螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結(jié)果（）

稀釋度 蜂膠含量（μg／片） 抑菌圈直徑（mm）實(shí)驗(yàn)序號(hào) 抑菌圈直徑（mm）1 2 3 41∶2 3500.0 31.10 33.10 31.40 33.00 32.15±0.911∶4 1750.0 32.88 30.00 30.40 29.80 30.77±1.241∶8 875.0 29.10 27.60 30.20 28.20 28.78±0.981∶16 219.00 27.60 24.40 29.20 32.80 28.50±3.021∶32 437.50 28.88 25.20 29.04 27.80 27.73±1.541∶64 109.50 25.80 23.20 24.96 23.08 24.26±1.161∶128 54.80 21.80 20.30 23.96 23.4 22.36±1.431∶256 27.40 20.40 24.00 20.80 22.2 21.85±1.411∶512 13.70 16.30 22.80 18.40 18.32 18.96±2.371∶1024 6.80 15.00 14.00 17.00 16.6 15.65±1.21

目前為止，關(guān)于蜂膠的臨床研究報(bào)道不多，Boyanova L等認(rèn)為保加利亞蜂膠有很強(qiáng)的劑量依賴(lài)的抑菌活性［5］。Boyanova L等認(rèn)為利用干燥的蜂膠紙片得到的保加利亞蜂膠具有重要的抗幽門(mén)螺桿菌的活性，也能夠抑制大腸彎曲菌以及空?qǐng)鰪澢纳L(zhǎng)，蜂膠在幽門(mén)螺桿菌感染的預(yù)防與治療方面具有巨大的潛力［6］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，95%乙醇溶解的黑龍江純蜂膠在不同濃度下對(duì)幽門(mén)螺桿具有較好的抑制作用，抑菌作用隨濃度降低而變小，從含量看明顯較陳煉等［7］報(bào)導(dǎo)的江西蜂膠效果好。與常用抗菌藥物相比，含6.80μg／片的蜂膠紙片抑菌圈直徑可達(dá)15.65mm，這與克拉霉素（15μg／片，＞17mm敏感，14～17mm中度敏感，＜14mm耐藥），呋喃唑酮（300μg／片，＞16mm 敏感，15～16mm 中度敏感，＜15mm耐藥），以及羥氨芐青霉素（40μg／片＞16mm 敏感，14～16mm中度敏感，＜14mm耐藥）相當(dāng)［8］。鑒于蜂膠不僅具有抗幽門(mén)螺桿菌的作用，還具有促進(jìn)組織愈合和抑制細(xì)胞增殖等作用，在抗生素類(lèi)藥物的耐藥性問(wèn)題日益突出的情況下，蜂膠作為一個(gè)多效的天然藥物，在幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)疾病治療方面可能具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］符軍放，曹煒，索志榮，等.高效液相色譜法識(shí)別蜂膠特征組分及定量對(duì)比［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，36（4）：587－591.

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［5］BOYANOVA L，GERGOVA G，NIKOLOV R，et al.Activity of Bulgarian propolis against 94Helicobacter pylori strains in vitro by agar－well diffusion，agar dilution and disc diffusion methods［J］.J Med Microbiol.，2005，54（5）：481－483.

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［8］中國(guó)藥品生物制品檢定所.抗菌藥物藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)［S］.1991：1.