魏 海，魏 霞

（1.四平市婦嬰醫(yī)院，吉林 四平 136000；2.四平巨能藥業(yè)有限公司，吉林 四平 136000）

研究蛋白質與藥物的相互作用不僅可以優(yōu)化藥物分子結構、優(yōu)化處方和給藥途徑，還可以為提高藥物的生物利用率和生物效應提供有用的信息。血清白蛋白能與許多內(nèi)源及外源性化合物結合，從而起到重要的存儲和轉運作用［1，2］。人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）二者的氨基酸序列高度相似，所以科學家通過研究藥物與BSA相互作用作為對HSA結合情況的參考。熒光光譜法因其操作簡單、快捷成為眾多研究方法中的熱點［3，4］。通過藥物對蛋白質內(nèi)源熒光的猝滅現(xiàn)象，確定猝滅機理及猝滅常數(shù)，可以了解藥物和蛋白的作用機理和作用強度。本文利用熒光光譜研究了生理條件下青霉素與牛血清白蛋白的相互作用機制，以及它們對BSA微環(huán)境的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑和儀器

本實驗所用到的主要試劑有青霉素（AR，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司）；牛血清白蛋白（AR，天津市福晨化學試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，AR，國藥集團化學試劑有限公司）；本實驗所用水均為去離子水。熒光光譜通過日本島津公司生產(chǎn)的RF－5301PC型熒光光譜儀獲得。

1.2 溶液配制

Tris－HCl溶液的配制：精確稱取0.5841g的氯化鈉溶解后轉移至100mL容量瓶中，再分別移取25mL濃度為0.2mol／L的Tris水溶液，以及40mL濃度為 0.1mol／L的HCl溶液至容量瓶中，最后用去離子水定容，配制成Tris－HCl鹽酸緩沖液。

BSA溶液的配制：精確稱取0.0750gBSA，用Tris－HCl溶液定容于1000mL容量瓶中，配制成1.67×10－5mol／L的BSA溶液。

1.3 實驗方法

分別定量移取“1.2”中配制的BSA和青霉素溶液于比色管中，在波長范圍為220～650nm，狹縫為0～3.0nm，激發(fā)波長為281nm條件下，記錄熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 青霉素和BSA的紫外及熒光光譜

圖1為BSA和青霉素在激發(fā)波長為281nm時的熒光光譜，可以看出BSA在328nm處有一特征峰，此峰為BSA在Trp－134和212位上色氨酸殘基（Trp）的特征峰。而青霉素在同樣條件下無特征吸收，為此本文以328nm作為青霉素與BSA作用的分析波長。探討青霉素對BSA的熒光猝滅作用。

圖1 青霉素（a）和BSA（b）的熒光光譜

2.2 結合常數(shù)Kq的確定

動態(tài)猝滅是熒光體與猝滅體由于熱運動等發(fā)生碰撞而引起的，靜態(tài)猝滅是熒光體與猝滅體形成絡合物，從而使熒光體的熒光猝滅。為了確定此猝滅過程的機制，先按動態(tài)猝滅過程處理，那么服從Stern－Volmer方程［5］：

其中F0為猝滅體不存在時的熒光強度，F(xiàn)為加入猝滅體后的熒光強度，kq為雙分子猝滅常數(shù)，c（Q）為猝滅體濃度，τ0為猝滅體不存在時熒光體的熒光壽命，τ0＝1ns，kq為Stern－Volmer常數(shù)，以F0／F－1對c（Q）作圖，結果如圖2。

圖2 BSA的熒光強度Fo／F－1與青霉素的Stern－Volmer

根據(jù)圖2可得青霉素與BSA在281nm波長激發(fā)下的雙分子猝滅常數(shù)kq＝2.46×1012mol／L·s。此值遠大于各種猝滅體對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010mol／L.S［6］，說明了此猝滅過程是由于熒光分子和猝滅劑之間形成不發(fā)光的基態(tài)配合物的結果，即發(fā)生了靜態(tài)猝滅［7］。圖3實驗結果證明在281nm波長激發(fā)下，BSA的熒光峰位在328nm，隨著青霉素濃度的增加，BSA的熒光強度有了不同程度的猝滅，而且BSA的熒光峰位沒有發(fā)生改變，所以初步確定加入藥物后，BSA的結構基本上沒有發(fā)生變化。由此推測，此猝滅過程可能是由于青霉素與BSA形成了締合物而引起的靜態(tài)猝滅，也就是說此猝滅過程是由于藥物與BSA在基態(tài)時生成了復合物，從而導致BSA的熒光強度猝滅。

自上而下青霉素的濃度分別為0，3.34×10－5，6.68×10－5，1.002×10－4，1，336×10－4，1.670×10－4，2.004×10－4，2.338×10－4，2.672×10－4，3.006×10－4，3.340×10－4mol／L。

根據(jù)方程［8］：

圖3 青霉素對BSA的熒光猝滅

以（F0／F0－F）－1對1／c（Q）作 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖（如圖4），直線斜率即為青霉素與BSA在281nm激發(fā)下的結合常數(shù)k＝3.347×10－3（K／mol）。

圖4 BSA的熒光強度與青霉素的雙倒數(shù)

3 結論

利用熒光光譜分析技術研究了青霉素和牛血清白蛋白相互作用機制，根據(jù)Lineweave－Burk雙倒數(shù)圖，求出了在281nm波長激發(fā)下青霉素與BSA作用的結合常數(shù)k＝3.347X10－3K／mol；依據(jù)Stern－Volmer方程，以F0／F－1對c（Q）作圖，求出了在281nm波長激發(fā)下青霉素與BSA作用的雙分子猝滅常數(shù)kq，kq＝2.46×1012mol／L·s。

［1］閔青民.幾種藥物小分子與生物大分子相互作用的研究［D］.南昌：南昌大學，2007.

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