解燕華，左 鐵，孟明耀，劉運洪，鄭建平，金醒昉，侯宗柳

（昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051）

多種細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokines induced killers,CIK） 是一類由多種細胞因子誘導(dǎo)的具有T細胞的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點。1991年由斯坦福大學(xué)的Schmidt-Wolf等報道后，現(xiàn)成為免疫治療多種惡性腫瘤應(yīng)用最為廣泛的細胞治療之一[1]。CIK細胞應(yīng)用于臨床需要足夠數(shù)量的細胞及良好的活性和細胞毒作用。但CIK細胞對乳腺癌的臨床治療效果有待于進行系統(tǒng)地臨床觀察。本研究對細胞增殖規(guī)律、細胞表型和細胞毒作用進行研究，同時進行近期臨床療效、免疫反應(yīng)及不良反應(yīng)的觀察。

材料和方法

一、研究對象：35例乳腺癌患者進行CIK細胞治療（最大年齡82歲，最小31歲，平均年齡56.57歲）。入組標準，組織學(xué)或細胞學(xué)確診為乳腺癌患者，接受過乳腺癌的規(guī)范化治療包括手術(shù)、化療，末次治療至開始接受CIK治療的間隔時間為4周；無法進行手術(shù)、放療、化療的中晚期患者，患者預(yù)期生存＞3個月；PS評分≧60分，無嚴重的病毒、細菌感染。本研究獲本單位倫理學(xué)委員會的批準，所有患者或由其法定代理人簽署了知情同意書，同意進行此免疫治療。排除標準，正在接受放療、化療或其他全身抗腫瘤治療者；同時存在其他惡性腫瘤及傳染性疾病者；大手術(shù)傷口未完全愈合者；懷孕期或哺乳期婦女；存在違反本試驗的體檢或?qū)嶒炇耶惓Ｕ?；對生物制品過無敏反應(yīng)者。

二、材料：RPMI1640購自美國Gibco公司?？谷薈D3單克隆抗體（Anti-CD3 mAb） 購自北京市晶美基因谷科技有限公司。IL-2購自江蘇金絲利有限公司。IFN－γ購自上海克隆生物高新技術(shù)有限公司。流式試劑CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP，CD3 FITC/CD56PE/CD45PerCP購自美國BD公司。胎牛血清購自HyClone公司。淋巴細胞分離液購自天津瑞灝生物制品科技有限責(zé)任公司。流式細胞儀為美國BD Calibur FACSTM。酶標分光光度計為美國Bio-Rad Model-680。二氧化碳孵箱為美國Forma SeriesⅡModel 3111。BEL-7404人肝癌細胞株由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫提供。

三、方法：1.CIK細胞培養(yǎng) 淋巴細胞提取，采用Ficoll離心分離，將分離的細胞密度調(diào)至1×109/L。分別懸于傳統(tǒng)RPM I1640培養(yǎng)基 （RPM I1640＋100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素） 和改良RPMI1640培養(yǎng)基（RPM I1640，100ml/L FBS，2mmol/L谷氨酰胺，100μg/L青霉素，100μg/L鏈霉素，HEPES 20mmol/L，丙酮酸鈉8mmol/L，β－巰基乙醇20μmol/L，適量的核苷酸和脫氧核苷酸），加入IFN－γ 1000U/ml，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h后，再加入抗人CD3mAb，50ng/ml，IL-21000U/ml 37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)9～12d行體外細胞表型和細胞增殖檢測。

2.細胞增值數(shù)量和表型測定 于培養(yǎng)當(dāng)天及9～12d用臺盼藍拒染法計數(shù)細胞，計算細胞擴增數(shù)量，同時用流式細胞術(shù)分析細胞CD3+CD56+。方法參照文獻[2]。

3.CIK細胞體外殺傷活性分析 取培養(yǎng)12d患者的CIK細胞作為效應(yīng)細胞，靶細胞為BEL-7404人肝癌細胞，按效靶比16∶1、8∶1、4∶1比例加入96孔培養(yǎng)板中，另設(shè)單獨靶細胞組和單獨效應(yīng)細胞組作為對照，在37℃，5%CO2培養(yǎng)48h后，棄未貼壁的死細胞，用1640培養(yǎng)液洗3次，加入5mg/ml MTT 50μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，然后每孔加入100μl DMSO溫育至結(jié)晶溶解，在570nm波長處檢測吸光值A(chǔ)，計算細胞毒活性[3,4]。

4.免疫治療計劃 每位患者在接受其他標準治療后4周，在完善治療前基線評估后，靜脈回輸CIK細胞，每次近似于2×109個，總體100ml，每3～5次為一療程。根據(jù)患者病情，每個患者進行3～4個療程治療。在完成上述規(guī)定治療后，所有患者在接受治療后即開始進入隨訪期。

5.療效評價與觀察指標 主要終點評價指標為無腫瘤進展時間，次要終點評價指標為近期療效和不良事件。無腫瘤進展時間定義為：接受免疫治療起到腫瘤進展時間。臨床療效評價：若有可評價病灶的患者的臨床療效評定，按照衛(wèi)生部頒布的實體瘤客觀療效評定標準進行。完全緩解(CR)：瘤體完全消失持續(xù)至少4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤最大直徑減少50%以上，持續(xù)至少4周；病情穩(wěn)定(SD)：腫瘤增大或縮小均不超過25%，無新病灶；病情進展(PD)：腫瘤增長大于25%或出現(xiàn)新的病灶。完全緩解+部分緩解為近期有效率，完全緩解+部分緩解+病情穩(wěn)定為疾病控制率。若無可評價病灶的患者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則為病情進展(PD)。接受治療后第4周、第8周評價近期臨床療效，復(fù)查胸部CT，評估臨床癥狀，血常規(guī)、血生化常規(guī)等；如懷疑有腫瘤轉(zhuǎn)移，加做相關(guān)檢查。

6.免疫學(xué)評價 接受治療后2周末，評價12例患者治療前后外周血中CD3+，CD4+，CD8+，CD56+的變化。

7.不良事件 依據(jù)美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應(yīng)標準，將各種不良事件分為0～Ⅳ度，Ⅰ度+Ⅱ度+Ⅲ度+Ⅳ度為毒性反應(yīng)發(fā)生率。

8.隨訪 所有患者在療效評價之后每3個月隨訪1次，行相關(guān)檢查。如懷疑有腫瘤轉(zhuǎn)移，加做相關(guān)檢查。病情進展的患者接受其他治療方案，仍然接受隨訪。截止時間為2010年3月31日。

9.統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包處理，均數(shù)±標準差（SD） 表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著意義。

結(jié) 果

一、細胞增殖結(jié)果：在CIK細胞分離培養(yǎng)3～6d細胞增值較慢，但是當(dāng)細胞在培養(yǎng)9d以后細胞增殖明顯，是一個快速增殖的過程，在12d以后達到了442.66±85.27。

二、細胞表型：CIK細胞在培養(yǎng)12d以后，CD3+CD56+達到了33%以上，在15～18d之后達到了50%左右。說明培養(yǎng)的CIK細胞能得到純度很高的細胞。

三、細胞毒活性：效靶比為4∶1、8∶1、16∶1時，細胞毒活性分別為37.13±11.44、56.91±10.43和77.06±11.62，其中效靶比為16∶1時細胞毒活性最大。

四、臨床療效評價：35例患者隨訪時間為3～15個月，患者普遍在輸注CIK細胞后精神癥狀好，同時增強食欲、改善睡眠、增強體力，增加體重。35例患者中，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期11例，失訪3例。所有的患者均為手術(shù)后實行CIK治療，20例治療了2個療程以上。最長隨訪時間為31月，中期隨訪時間為15個月。近期療效評價中，完全緩解24例，部分緩解6例，病情穩(wěn)定1例，近期有效率為85.71%，疾病控制率為88.57%，無腫瘤進展時間為2～31個月，中位無腫瘤進展時間為15個月。

五、免疫學(xué)療效評價：治療結(jié)束后2周末，所有患者CD3+，CD4+，CD8+均較治療之前有明顯升高（P≤0.001），提示該療法提高了患者體內(nèi)的CD3+CD4+，CD8+基礎(chǔ)水平，可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，見附表。

附表 CIK治療乳腺癌前后的免疫學(xué)療效評價

六、不良事件分析：在接受CIK細胞過繼免疫治療的35例患者中，依據(jù)美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應(yīng)標準，并未出現(xiàn)Ⅲ度+Ⅳ度的嚴重不良反應(yīng)。1例出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)。

討 論

免疫細胞過繼療法已成為放、化療后，對腫瘤患者進行輔助治療的重要手段之一，對于促進患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變，以及骨髓凈化都具有良好的效果。CIK細胞是一類由多種細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞，體外實驗表明，其具有較好的擴增性能和很強的腫瘤殺傷活性[5,6]，而對于自身組織則沒有細胞毒作用，但將其應(yīng)用于臨床，必須有足夠的數(shù)量和較強的細胞毒活性。我們培養(yǎng)中采用最常用的細胞因子組合：IFN-γ＋CD3＋IL-2刺激誘導(dǎo)CIK細胞增殖，結(jié)果表明，細胞純度在12達到34.44%左右，與文獻報道相符。細胞毒活性，CIK細胞培養(yǎng)13d后，對BEL-7404細胞殺瘤率平均是77.06±11.62，達到了較強的細胞毒活性。

本研究中對35例乳腺癌患者治療后臨床療效主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是大多數(shù)病例經(jīng)過手術(shù)、化療等治療的同時或之后，輸注CIK細胞治療可以在不損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細胞，進一步達到清除體內(nèi)殘留癌細胞的目的；二是該療法提高了患者體內(nèi)的CD3+CD4+基礎(chǔ)水平，可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，大大提高患者自身免疫力。三是一定程度上減輕病人的痛苦，提高生活質(zhì)量，同時增強食欲、改善睡眠、增強體力，增加體重。

CIK細胞療法既可應(yīng)用于乳腺癌的治療，對于手術(shù)切除、化療等治療的同時或治療后的病人療效更佳。并且還能調(diào)節(jié)和增強全身免疫機能，在體內(nèi)長期發(fā)揮抗腫瘤的活性，除可以消滅體內(nèi)的腫瘤細胞外，還可防止腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。更重要的是，CIK細胞療法對人體正常細胞、機體免疫系統(tǒng)沒有任何傷害，是一種安全可靠、無副作用的腫瘤治療方法。此外，CIK細胞療法在內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上，對無法進行手術(shù)、晚期和高齡患者進行聯(lián)合治療，從而達到延長患者生命的目的。

［1］SCHMIDT-WOLF GD,NEGRIN RS,SCHMIDT-WOLF IG.Actived T cells and cytokine-induced CD3+CD56+killer cells[J].Annals ofHematology,1997,74:51-56.

［2］潘春華,羅榮城.CIK細胞的表型分析及生物學(xué)活性研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2003,28(11):1030-1032.

［3］任歡,徐紅薇.CIK細胞的體外增殖及殺瘤活性的實驗研究[J].中國免疫學(xué)雜志,1998,14(6):406-408.

［4］李淑艷,楊秀珍.MTT法檢測CIK細胞的體外殺瘤活性[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,24(1):3-5.

［5］SCHMIDT-WOLF IG,LEFTEROVA P,JOHNSTON V,et al.Propagation of large numbers of T cells with natural killercell markers[J].Br J Haematol,1994,87(3):453.

［6］FINKE S,TROJANECK B,LEFIEROVA P,et al.Increase of proliferation rate and enhancement of antitumor cytoxicity of expanded human CD3+CD56+immunologic effector cells by receptor-mediated transfection with the interleukin-7 gene[J].Gene Ther,1998,5(1):31.