楊延軍， 邱偉婷， 黃 剛， 陳 飛， 馬立峰， 張子清

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院， 廣東 深圳 518116)

周圍神經(jīng)損傷在臨床上極為常見。盡管周圍神經(jīng)修復(fù)技術(shù)已有了長足的進(jìn)步，但即使是新鮮、清潔的周圍神經(jīng)斷裂傷，及時采用先進(jìn)的顯微外科技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，通常也不可能獲得完全再生，功能也往往不能完全恢復(fù);而長時間的感覺或運(yùn)動的缺失將引起肌肉萎縮、關(guān)節(jié)攣縮畸形等［1］。因此，如何促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的再生，最大限度地恢復(fù)其功能，一直是神經(jīng)修復(fù)的基礎(chǔ)和臨床研究的熱點。其中神經(jīng)修復(fù)的顯微外科手術(shù)包括：神經(jīng)松解術(shù)、神經(jīng)縫合術(shù)、神經(jīng)移植術(shù)、神經(jīng)移位術(shù)和神經(jīng)束植入骨骼肌術(shù)等［1，2］。本研究擬對家兔失神經(jīng)支配腓腸肌神經(jīng)束植入后其肌濕質(zhì)量、肌肉收縮能力的變化以及乙酰膽堿酯酶含量的變化進(jìn)行連續(xù)觀察，為臨床尋找檢測肌肉萎縮程度方法和評價神經(jīng)束植入術(shù)的療效。

1 材料與方法

1.1 失神經(jīng)支配腓腸肌神經(jīng)束植入動物模型的制作：家兔48只(廣東省實驗動物中心)，體重2.5 0.5kg/只，不拘雌雄，隨機(jī)分為3組，神經(jīng)植入組、神經(jīng)吻合組及對照組，每組16只。動物麻醉后，在放大10倍手術(shù)顯微鏡下，實驗組于右側(cè)梨狀肌下緣尋找坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)尋找其脛神經(jīng)分支，將其進(jìn)入腓腸肌的分支干進(jìn)入肌肉表面切斷，然后將按神經(jīng)束神經(jīng)干分割成數(shù)支。神經(jīng)植入組用10－0號顯微縫合線根據(jù)肌內(nèi)神經(jīng)的分布情況選擇性植入分別植入腓腸肌肌肉組織內(nèi);神經(jīng)吻合組對坐骨神經(jīng)發(fā)出支配腓腸肌分支后約1cm切斷，用10－0號顯微縫合線進(jìn)行端－端吻合;對照組則于神經(jīng)切斷后并切除進(jìn)入腓腸肌分支1－2mm，阻止神經(jīng)的自然生長。分別于術(shù)后 2、4、6、8、12、16、20 及 24周處死取兩組右小腿腓腸肌作實驗觀察。

1.2 肌肉濕重測定：將各時期處死家兔自股骨內(nèi)外髁起點至跟骨結(jié)節(jié)止點完整取下腓腸肌，20℃用萬分之一天平稱其體重。

1.3 肌肉收縮功能的測定：家兔麻醉后，固定、游離右側(cè)腓腸肌，保留血供，切斷腓腸肌遠(yuǎn)端肌腿并用絲線將肌腿直接與肌肉張力換能器水平相連，肌肉周圍不斷滴注37℃溫鹽水，局部烤燈保濕，用特制細(xì)銅絲雙極電極距入肌點2mm處直接刺激支配神經(jīng)，刺激頻率為1Hz和40Hz，波寬20ms，作張力－長度曲線，記錄到最合適收縮長度后，分別記錄肌肉單收縮力和最大強(qiáng)直收縮力。

1.4 乙酰膽堿酯酶染色觀察：將各時期動物取材標(biāo)本解剖顯微鏡下分離出肌束，行膽堿酯酶染色4℃下60min(染色孵育液配制：0.1moL順丁烯二酸溶液(pH6.0)6.5mL內(nèi)依次加入碘化乙酰硫代膽堿5mg，0.1moL枸櫞酸鈉溶液0.5mL，20nmoL硫酸銅溶液1.5mL，蒸餾水2mL，5nmoL鐵氰化鉀溶液1mL，蔗糖1g)染色后直接壓片光學(xué)顯微鏡下觀察，應(yīng)用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，對各組取材乙酰膽堿酯酶含量進(jìn)行測定，每個實驗動物取3張切片，400倍光鏡下隨機(jī)選取20個運(yùn)動終板，檢測乙酰膽堿酯酶染色的縱斷面光鏡切片酶的灰度值(酶含量的灰度值為實際含量的倒數(shù)，數(shù)值越小，含量越高)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用s表示，兩組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

術(shù)后不同時間點不同組間肌濕質(zhì)量結(jié)果見表1，隨著時間延長，神經(jīng)植入組間肌濕質(zhì)量逐漸增加，神經(jīng)吻合組肌濕質(zhì)量呈緩慢上升趨勢。對照組肌濕質(zhì)量呈緩慢下降趨勢。神經(jīng)植入組在第12周時肌濕質(zhì)量開始大于神經(jīng)吻合組(P＞0.05)。術(shù)后不同時間點不同組間單肌收縮力的變化見表2，隨著時間延長，神經(jīng)植入組單肌收縮力逐漸增加，到16周時，神經(jīng)植入組與對照組單肌收縮力已經(jīng)沒有差別。術(shù)后不同時間點不同組間肌肉收縮力的變化見表3，隨著時間的延長，神經(jīng)植入組單肌收縮力明顯增加。術(shù)后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶含量的變化見表4，在16周前，膽堿酯酶含量的變化不是很明顯，16周后，植入組膽堿酯酶含量明顯增加。

表1 術(shù)后不同時間點不同組間肌濕質(zhì)量變化分析(s，n=16)

表1 術(shù)后不同時間點不同組間肌濕質(zhì)量變化分析(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P ＜0.01，＊P ＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，##P ＜0.01，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 1.275 0.064＊ 1.280 0.057＊ 1.280 0.042＊ 1.303 0.023＊ 1.335 0.007＊#1.405 0.007＊＊#1.515 0.035＊＊#1.770 0.014＊＊##神經(jīng)吻合組 1.180 0.050 1.165 0.064 1.180 0.071 1.220 0.028 1.220 0.014＊ 1.230 0.014＊＊ 1.240 0.141 1.310 0.014＊對照組 0.975 0.035 0.940 0.014 0.925 0.007 0.915 0.007 0.905 0.007 0.895 0.007 0.895 0.021 0.8800.014

表2 術(shù)后不同時間點不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

表2 術(shù)后不同時間點不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 44.5 0.7# 51.0 1.4# 54.5 0.7＊# 61.0 1.4＊# 65.5 0.7＊＊# 71.0 1.7＊＊ 71.0 3.4＊＊ 79.0 1.4＊＊神經(jīng)吻合組 67.5 0.7＊ 70.0 2.8＊ 72.5 1.7＊＊ 74.0 1.4＊＊ 75.5 2.7＊＊ 75.5 3.7＊＊ 75.5 1.7＊＊ 75.5 0.7＊＊對照組 41.5 2.1 46.5 0.7 48.5 0.7 50.5 0.7 47.5 0.7 45.5 0.7 45.5 0.7 44.70.6

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮及運(yùn)動終板退變的防治一直是周圍神經(jīng)外科研究領(lǐng)域的難題。骨骼肌及運(yùn)動終板的狀態(tài)決定著神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。

Sunderland［3］發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)維持需靠一些神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，失神經(jīng)支配后最大變化是這些神經(jīng)營養(yǎng)因子丟失導(dǎo)致的肌肉形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及新陳代謝等方面改變。而失神經(jīng)支配肌肉在形態(tài)學(xué)上首先表現(xiàn)為肌細(xì)胞漿丟失及直徑減少。骨骼肌失神經(jīng)支配后組織形態(tài)學(xué)改變：周圍神經(jīng)損傷后，骨骼肌因失去神經(jīng)營養(yǎng)及廢用而發(fā)生萎縮。隨著失神經(jīng)營養(yǎng)時間的延長，這種萎縮會逐漸加重，其質(zhì)量也會較前逐漸減輕，腓腸肌肌濕質(zhì)量恢復(fù)率的高低取決于該肌重獲坐骨神經(jīng)再生纖維支配的間隔時間的長短和能與其運(yùn)動終板有效連接的再生神經(jīng)纖維的多少，所以腓腸肌(濕質(zhì)量)恢復(fù)率可作為衡量坐骨神經(jīng)再生效果的一項重要指標(biāo)。在本研究中，神經(jīng)植入組腓腸肌肌濕質(zhì)量在手術(shù)后第2周就明顯重于對照組(P＜0.05)，且隨著時間延長，神經(jīng)植入組腓腸肌肌濕質(zhì)量增重明顯，這種差異愈發(fā)明顯。神經(jīng)吻合組肌濕質(zhì)量呈緩慢上升趨勢，在12周時，與神經(jīng)植入組比較，差異開始具有統(tǒng)計學(xué)意義，神經(jīng)植入組重于吻合組(P＜0.05)。從而表明神經(jīng)植入對神經(jīng)功能的恢復(fù)及神經(jīng)再生的效果優(yōu)于神經(jīng)吻合。而對照組因失神經(jīng)支配后，骨骼肌因失去神經(jīng)營養(yǎng)及費用而發(fā)生萎縮，所以質(zhì)量較前逐漸減輕。

神經(jīng)植入組與吻合組肌肉單肌收縮力與強(qiáng)直收縮力在術(shù)后均不斷增強(qiáng)，但植入組增加更快，這說明神經(jīng)植入能明顯改善肌肉的收縮性能。

在正常生理狀態(tài)下，運(yùn)動神經(jīng)元通過運(yùn)動終板與骨骼肌纖維建立聯(lián)系，支配骨骼肌完成各種生理功能。神經(jīng)損傷后，近端軸突逆行潰編，神經(jīng)元受損乃至死亡;遠(yuǎn)端軸突及運(yùn)動終板發(fā)生變形改變。骨骼肌纖維也因失去了神經(jīng)營養(yǎng)而發(fā)生變形以及酶活性和分布的改變。遠(yuǎn)端軸突發(fā)生waller變形，導(dǎo)致運(yùn)動終板乙酰膽堿酯酶活性下降。

神經(jīng)再生時，運(yùn)動終板乙酰膽堿酯酶活性恢復(fù)正常。乙酰膽堿酯酶主要來源于運(yùn)動神經(jīng)元胞體，通過軸突快速運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)終末，乙酰膽堿酯酶活性的強(qiáng)弱反映運(yùn)動神經(jīng)元的功能狀態(tài)［4］。終板區(qū)乙酰膽堿酯酶含量多少亦可能反映終板退變及再生情況［5］。在本研究中，神經(jīng)植入組及吻合組乙酰膽堿酯酶均呈上升趨勢，在第20周時，植入組乙酰膽堿酯酶含量明顯高于對照組(P＜0.05)。而對照乙酰膽堿酯酶含量變化不明顯。乙酰膽堿酯酶對乙酰膽堿有特異性水解作用，主要分布于運(yùn)動終板處的突觸前膜及后膜，神經(jīng)發(fā)放的沖動通過運(yùn)動終板將乙酰膽堿傳遞給肌肉，從而引起肌肉收縮。終板區(qū)乙酰膽堿酯酶含量的多少能夠反映出運(yùn)動神經(jīng)元的功能狀態(tài)和運(yùn)動終板退變和再生的情況［6］。本實驗中，神經(jīng)植入組在術(shù)后16周前，膽堿酯酶含量沒有明顯變化，16周后明顯升高，Hu等認(rèn)為運(yùn)動終板和膠原纖維的消失是影響去神經(jīng)支配晚期療效的主要因素，從而表明神經(jīng)植入晚期療效明顯。

表3 術(shù)后不同時間點不同組間肌肉強(qiáng)直收縮力的變化(s，n=16)

表3 術(shù)后不同時間點不同組間肌肉強(qiáng)直收縮力的變化(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 241.5 2.12#＊＊ 252.2 1.45#＊＊ 270.5 2.76＊＊#341.0 1.45＊＊＊#445.5 10.7＊＊ 471.0 11.4＊＊ 481.0 12.6＊＊ 479.0 16.4＊＊神經(jīng)吻合組 427.0 31.11＊＊ 429.0 12.87＊＊ 432.5 12.77＊＊ 434.0 1.4＊＊ 455.5 0.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 478.5 20.7＊＊對照組 150.5 7.77 146.5 6.74 148.5 7.78 146.5 6.74 137.5 6.32 135.5 8.76 125.5 8.77 124.69.65

表4 術(shù)后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

表4 術(shù)后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

所測數(shù)據(jù)為酶含量的灰度值－實際含量的倒數(shù)，數(shù)值越小，含量越高注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 121.5 12.12 122.2 11.45 130.5 12.76 141.0 11.45 145.5 10.7 171.0 11.4＊ 281.0 12.6＊＊#289.0 16.4＊＊#神經(jīng)吻合組 127.0 31.11 129.0 12.87＊＊ 132.5 12.77＊＊ 134.0 11.4 155.5 20.7 175.5 30.7＊ 175.5 20.7＊ 178.5 10.7＊對照組 120.5 17.77 126.5 16.74 128.5 17.78 146.5 6.74 137.5 16.32 135.5 18.76 125.5 18.76 129.619.65

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