謝甲貝 張慶瑜 康春生 韓 靜 王 濤 張 潔

多數(shù)惡性腫瘤在發(fā)現(xiàn)時已伴有不同程度的轉移，研究其侵襲和轉移機制意義重大。蛋白激酶B（PKB或Akt）通路即以絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族為中心的信號傳導通路，是近年來腫瘤研究的熱點。作為多種信號轉導通路的焦點，其通過下游通路影響腫瘤細胞多重生物學效應，調節(jié)包括侵襲和轉移在內的多種細胞內進程[1-2]。Akt亞型Akt1、Akt2在腫瘤發(fā)生過程中的作用不盡相同，在不同細胞系中對侵襲和轉移的影響甚至相反[2]。本研究將外源性Akt1、Akt2基因導入人胃黏膜上皮細胞GES-1中，觀察并分析兩者對GES-1的影響，旨在從其侵襲力和遷移方面探討Akt1、Akt2基因導致正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及質粒 GES-1購自北京百和營科技發(fā)展有限責任公司。p-LXSN質粒及含Akt1和Akt2基因全cDNA序列的p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2質粒由美國南佛羅里達大學Dr.Jin Q.Cheng惠贈。

1.1.2 主要試劑與儀器 質粒抽提、純化試劑盒和總蛋白提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，脂質體Lipo?fectamineTM2000、DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、抗生素G418購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人Akt1、Akt2、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、抗絲狀肌動蛋白（F-actin）單抗購自美國San?ta Cruz公司，抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（抗GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗兔IgG抗體、免疫熒光單克隆抗體FITC標記二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒和化學發(fā)光檢測系統(tǒng)購自美國Pierce公司（SuperSignal West Pico 34080）；Olympus光學顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因轉染和克隆篩選 人胃黏膜上皮細胞GES-1體外細胞株培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為濕潤狀態(tài)下37℃，5%CO2。當細胞生長到60%~70%融合時，參照脂質體LipofectamineTM2000說明書分別轉染p-LXSN-Akt1（Akt1組）、p-LXSN-Akt2質粒（Akt2組），48 h后，換用含400 mg/L G418的完全培養(yǎng)基篩選，3周后選出抗性克隆株繼續(xù)擴大培養(yǎng)，以正常未轉染的GES-1細胞為對照組，以轉染空載質粒p-LXSN的細胞株為空載組。

1.2.2 Western blot法檢測蛋白表達 將各組細胞培養(yǎng)至約5×107時，按總蛋白提取試劑盒說明書分別提取各組待測細胞的總蛋白，并檢測樣品蛋白濃度。將各組細胞總蛋白按比例與5倍上樣緩沖液混合，置100℃沸水中煮15 min。取等量蛋白樣品溶液及蛋白Marker上樣進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，然后將凝膠電轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，置于膜封閉液中封閉過夜。加入一抗為兔抗人Akt1、Akt2、MMP-2 單抗（1∶1 000），二抗為HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1∶1 000）。用增強化學發(fā)光法（ECL）顯色，化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。洗膜后GAPDH二次雜交檢測作為內對照。實驗重復3次。

1.2.3 Transwell體外侵襲實驗 應用12孔Transwell侵襲小室進行侵襲實驗。上室的聚碳酸酯膜-Matrigel（5 g/L）在37℃聚合后，在上室孔中分別準確加入各組細胞1×105個/孔（無血清培養(yǎng)基的單細胞懸液），下室中加入趨化因子600 μL（小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞48 h無血清的條件培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)時間結束后將Transwell上室的附著細胞用濕棉簽擦去、蘇木精染色，封片后顯微鏡下直接（200倍）觀察穿過膜的細胞數(shù)。每張膜中央部分和周圍部分各隨機取3個視野，計數(shù)每個視野內的穿過8 μm微孔的細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.2.4 免疫熒光檢測細胞骨架 備帶有滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，每孔接種3×105個細胞于4 mL培養(yǎng)液中。24 h后取蓋玻片做如下處理：4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗滌3次，每次10 min，加0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）處理15 min，PBS液洗滌3次，每次5 min；1%胎牛血清封閉40 min；滴加一抗anti-F-actin（1∶100）置濕盒中4℃過夜（16~24 h），PBS沖洗3次，滴加異硫氰酸熒光素（FITC）標記二抗（1%牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖液BSA-PBS稀釋），37℃濕盒內孵育2 h，50%緩沖甘油封固，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 以上實驗各組都設3組平行樣本，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示,采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染Akt1和Akt2基因的GES-1細胞的篩選 p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2質粒分別轉染GES-1細胞后，在G418（400 mg/L）作用下大部分細胞死亡，培養(yǎng)約10 d后可見剩余細胞成島狀生長，經(jīng)過3周的G418抗性篩選，獲得生長良好的抗性克??；而正常未轉染GES-1細胞在10 d左右完全死亡。

2.2 轉染Akt1、Akt2基因的GES-1細胞蛋白的表達 與對照組和空載組相比，Akt1組中Akt1蛋白的表達水平明顯升高，MMP-2蛋白表達量同步增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Akt2組中Akt2蛋白的表達水平較對照組和空載組亦明顯升高，MMP-2蛋白表達量亦同步增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1、表1。

表1 各組相應蛋白表達量及細胞穿出微孔數(shù)比較（n=3±s）

表1 各組相應蛋白表達量及細胞穿出微孔數(shù)比較（n=3±s）

**P<0.01

0.63±0.05 0.59±0.03 0.96±0.04 0.63±0.05 150.325**0.136<0.001 0.780<0.001 0.081<0.001 0.58±0.05 0.62±0.02 0.62±0.03 0.95±0.04 242.903**0.099 0.052<0.001 0.785<0.001<0.001 0.41±0.03 0.39±0.02 0.74±0.02 0.76±0.03 419.010**0.131<0.001<0.001<0.001<0.001 0.090 21.51±3.05 21.74±2.34 61.03±1.53 65.22±3.09 258.207**0.916<0.001<0.001<0.001<0.001 0.083對照組（1）空載組（2）Akt1組（3）Akt2組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）組別 Akt1 Akt2 MMP-2穿出細胞數(shù)（個）

2.3 Transwell細胞侵襲實驗 Akt1組和Akt2組平均每個視野穿出微孔細胞數(shù)分別較對照組和空載組增加，侵襲能力增強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而對照組和空載組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2、表1。

2.4 免疫熒光檢測細胞骨架 相對于空載組和對照組，Akt1組和Akt2組F-actin聚集增加，見圖3。

3 討論

惡性腫瘤的轉移是影響患者生活質量和死亡的最主要原因。Akt通路與腫瘤發(fā)、生發(fā)展密切相關，在導致其生長增殖和侵襲轉移方面發(fā)揮著重要作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，活化的Akt1促進人類胃癌、胰腺癌、纖維肉瘤和成纖維細胞的侵襲能力[4]。降低Akt1的表達后，內皮細胞向基質蛋白的黏附及遷移能力明顯降低，Akt1表達缺失的內皮細胞向纖維蛋白原及玻璃黏連蛋白的黏附能力低于野生型的內皮細胞[5]。Akt2的高表達和突變不僅在膠質瘤組織中可以檢測到，而且在乳腺癌、大腸癌以及卵巢癌組織中也可以檢測到。Zhang等[6]在膠質瘤細胞系LN-229中通過小干擾RNA（siRNA）技術下調Akt2基因表達后，發(fā)現(xiàn)膠質瘤細胞的運動黏附和侵襲能力明顯降低，動物體內實驗也進一步驗證了這個結論。以上研究均表明Akt的亞型在腫瘤發(fā)生、轉移中起到重要作用。

細胞遷移是細胞位置改變的動態(tài)過程，它是一種復雜的細胞行為，在胚胎發(fā)育、傷口愈合和腫瘤細胞侵襲等方面發(fā)揮重要作用，且貫穿于腫瘤轉移的全過程。肌動蛋白是細胞骨架中微絲的主要成分，而細胞骨架是細胞運動的結構基礎，它通過自身結構的動態(tài)重組實現(xiàn)細胞遷移，在腫瘤轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。Qian等[7]研究發(fā)現(xiàn)在雞胚纖維細胞中活化的Akt形式（Myr-P3k）的足量表達能通過下游效應分子P70S6K1誘導肌動蛋白生成和細胞遷移。Zhang等[6]在膠質瘤細胞系LN-229中下調Akt2后，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（EGF）刺激產(chǎn)生的F-actin聚集減少，蛋白印跡驗證MMP-9蛋白表達降低；Akt2基因可能通過增加Akt磷酸化增強蛋白（Girdin蛋白）調控細胞骨架，影響細胞黏附，促進膠質瘤侵襲和遷移。上述研究都說明Akt亞型通過下游信號傳導通路調控細胞骨架，影響細胞遷移能力。

在哺乳動物細胞內，Akt的2個亞型在腫瘤轉移中的作用比較復雜。研究表明，Akt1過表達可以抑制多個乳腺癌細胞系的侵襲性遷移，而應用siRNA技術沉默Akt1表達后卻導致了細胞的運動和上皮細胞向間質細胞的轉化，從而加劇腫瘤的轉移[8]。相反，在不同乳腺癌細胞系用siRNA技術下調Akt2的表達均抑制了細胞的趨化運動和腫瘤的轉移[9]。而胰腺癌細胞中Akt1和Akt2均通過上調胰島素樣生長因子-I（IGF-I）受體促進腫瘤的轉移[10]?；?Akt1，Akt2基因表達與GES-1細胞的運動、遷移的作用機制尚未明了，本研究采用脂質體法分別將含Akt1和Akt2基因全長cDNA序列的質粒轉染到人胃黏膜上皮GES-1細胞，成功地建立了穩(wěn)定表達Akt1及Akt2蛋白的GES-1細胞。Transwell法分析表明轉染Akt1和Akt2基因的GES-1細胞侵襲能力增強，蛋白印跡顯示MMP-2表達均相應升高。免疫熒光示轉染Akt1和Akt2基因后細胞骨架F-actin聚集增加，從側面反映了細胞向惡性方面轉化。然而，Akt1、和Akt2基因在某些細胞系中（如胰腺癌細胞系）作用一致，在某些細胞系中（如乳腺癌細胞系）作用相反，這可能與Akt亞型的功能不同及細胞特異性有關，也可能與不同細胞類型信號傳導通路異同有關，需要進一步研究探討，期待為抑制GES-1細胞惡性轉化的新方法。

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