宗文康 孫保存 孫 濤 董學易 劉艷榮 古 強 趙秀蘭

線形程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）是近年來發(fā)現的一種規(guī)律性的Caspases依賴性的腫瘤細胞群體死亡模式，其與血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）、內皮依賴性血管（endothelium-dependent vessels，EV）的形成有關[1-2]。上皮-間充質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞失去上皮表型轉變?yōu)榫哂羞w移能力的間充質表型的現象。EMT參與了VM的形成過程[3]。本實驗通過構建黑色素瘤小鼠模型，研究在LPPCN和VM形成中，Caspase 8、9對EMT調控蛋白Twist1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 C57BL6小鼠96只，6~8周齡，平均體質量（21.0±1.9）g，購自北京軍事醫(yī)學科學院，清潔實驗室飼養(yǎng)，飲用水和飼料均由天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Cas?pase 8抑制劑Z-IETD-FMK和Caspase 9抑制劑Z-LEHD-FM購自SIGMA公司，按照相應劑量分別溶于0.1 mL含10%DMSO的生理鹽水中，藥物終劑量均為100 μg/kg。兔多抗Twist1抗體和sc-15393均購自Santa Cruz公司，工作濃度為1∶50。

1.2 方法

1.2.1 B16黑色素瘤小鼠模型的建立及分組 將低溫保存的B16黑色素瘤組織于43℃的熱水中迅速升溫20~30 s，然后以1 000 r/min離心10 min，吸取上清液后，剪碎瘤組織，加入生理鹽水制成瘤細胞懸液（細胞濃度為2×109/L）。于小鼠蹊部注射瘤細胞懸液0.2 mL/只。待小鼠荷瘤后隨機分為Caspase 8抑制劑組（8抑制劑組），Caspase 9抑制劑組（9抑制劑組），Caspase 8、9抑制劑聯合用藥組（聯合組）及對照組,每組24只。

1.2.2 給藥方法 （1）8抑制劑組：于小鼠瘤周皮下注射Cas?pase 8抑制劑0.1 mL/d。（2）9抑制劑組：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 9抑制劑0.1 mL/d。（3）聯合組：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 8抑制劑0.1 mL/d和Caspase 9抑制劑0.1 mL/d。（4）對照組：于小鼠瘤周皮下注射含10%DMSO的生理鹽水0.1 mL/d。

1.2.3 免疫組織化學染色 斷頸法處死小鼠后剖取移植瘤，福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，采用二步法進行免疫組織化學染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，3%雙氧水滅活內源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，抗原微波熱修復，正常山羊血清封閉、一抗4℃冰箱過夜，二抗1 h，DAB顯色10~15 min，蘇木精復染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 計數方法 在低倍鏡（×100）下找到典型區(qū)域，高倍鏡（×400）下連續(xù)計數10個高倍視野中LPPCN周圍和VM周圍第1~4層腫瘤細胞核和胞漿的染色指數，取其平均值[4]。染色指數=陽性率積分+染色強度。陽性率積分的評定：陽性率<25%為0分，26%~50%為1分，51%~75%為2分，≥76%為3分；染色強度評定：腫瘤細胞無著色為0分，染成淺黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色為3分。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

Twist1在細胞核和細胞漿中皆有表達，見圖1。4組LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1，且有逐層遞減趨勢，見表2；同層不同組的LPPCN腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數，聯合組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01），見表1。LPPCN和VM周圍第1~4層腫瘤細胞、同一層不同組的腫瘤細胞胞漿,VM周圍第1~4層腫瘤細胞、同一層不同組的腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），見表3~5。

表1 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數的比較 （n=24x±s）

表1 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數的比較 （n=24x±s）

*P<0.05，**P<0.01

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表2 同一組別不同層兩兩比較的P值

表3 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞漿Twist1陽性染色指數的比較 （n=24， ±s）

表3 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞漿Twist1陽性染色指數的比較 （n=24， ±s）

均P>0.05，表3、4同

組別8抑制劑組9抑制劑組聯合組對照組F第1層4.45±0.17 5.00±0.21 4.90±0.15 5.27±0.15 2.488第2層4.57±0.16 5.00±0.20 4.91±0.15 5.18±0.16 2.292第3層4.88±0.18 5.00±0.15 4.59±0.14 5.23±0.19 0.062第4層4.88±0.18 4.91±0.19 4.64±0.16 5.09±0.16 2.262 F 0.096 0.054 1.309 0.226

表4 VM周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數的比較 （n=24±s）

表4 VM周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1陽性染色指數的比較 （n=24±s）

組別8抑制劑組9抑制劑組聯合組對照組F第1層5.13±0.30 5.43±0.30 5.33±0.24 5.38±0.26 0.233第2層4.88±0.23 5.29±0.29 5.11±0.31 5.00±0.42 0.275第3層4.63±0.32 5.14±0.34 4.78±0.36 4.88±0.23 0.426第4層4.63±0.38 5.14±0.34 4.78±0.37 4.50±0.27 0.608 F 0.906 0.189 0.711 1.406

表5 VM周圍第1~4層腫瘤細胞漿Twist1陽性染色指數的比較 （n=24 ±s）

表5 VM周圍第1~4層腫瘤細胞漿Twist1陽性染色指數的比較 （n=24 ±s）

組別8抑制劑組9抑制劑組聯合組對照組F第1層5.10±0.18 5.32±0.22 4.76±0.15 5.33±0.14 2.186第2層4.95±0.19 5.22±0.26 4.64±0.18 5.23±0.15 1.756第3層4.86±0.16 4.91±0.21 4.55±0.18 4.95±0.19 1.120第4層4.95±0.15 4.96±0.21 4.45±0.17 5.05±0.19 2.105 F 0.35 0.76 0.57 1.01

3 討論

VM是Maniotis等[5]發(fā)現的一種不依賴于血管內皮的腫瘤微循環(huán)模式。在腫瘤快速生長早期，腫瘤組織內部處于高壓、缺氧狀態(tài)，內皮細胞很難長入腫瘤組織，因此EV生長無法滿足腫瘤細胞快速生長的需要。VM的形成可有效緩解腫瘤快速生長早期腫瘤細胞微環(huán)境的缺氧狀態(tài)。此后VM逐漸被EV所取代，馬賽克血管（Mosaic Vessels，MV）則是處于VM和EV過渡階段的血液供應模式，這就是腫瘤血管生成的三階段學說[4]。因此VM是腫瘤組織生長早期重要的功能性血管，可有效地改善腫瘤內部的缺氧環(huán)境，與腫瘤生長、侵襲和轉移等生物學行為有關。本課題組前期研究發(fā)現黑色素瘤中存在一些深染的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞呈線形分布或網狀分布，胞核深染、碎裂、胞漿濃縮、細胞間彼此分離，并與內皮依賴性血管相通[2]，這些深染的腫瘤細胞被命名為LPPCN。與凋亡和壞死這2種經典的細胞死亡模式不同，LPPCN是主動性的，腫瘤細胞群體發(fā)生的，并且沒有炎細胞浸潤的腫瘤細胞死亡模式。在LPPCN過程中，Caspases發(fā)揮著重要作用[6-7]。發(fā)生LPPCN的腫瘤細胞原位缺口末端標記染色陰性，Caspase 3、Caspase 9免疫組織化學染色陽性[1]。發(fā)生LPPCN的腫瘤細胞死亡脫落后形成的管腔樣空隙可能為VM、EV的形成提供一定的空間結構基礎[1]。LPPCN常發(fā)生于血液供應無法到達、缺氧最嚴重的腫瘤細胞，而LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細胞則處于相對缺氧狀態(tài)，這些瀕死的腫瘤細胞可能啟動一系列機制發(fā)生EMT，對抗缺氧微環(huán)境。腫瘤細胞發(fā)生EMT后上皮細胞喪失上皮特性，即細胞間黏附能力和細胞極性的喪失，同時獲得間充質細胞的特性，即細胞侵襲、轉移能力和抗凋亡能力的增強[8-9]。在缺氧環(huán)境下缺氧誘導因子（HIF）1高表達可以誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT。LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細胞發(fā)生EMT后，不僅發(fā)生了形態(tài)學上的改變，還具有了自分泌細胞因子和細胞外基質的能力，為VM的形成提供物質基礎。

參與EMT過程的轉錄調節(jié)因子主要有Twist1、Snail和Slug等。Twist1是一種螺旋-環(huán)-螺旋的轉錄因子，在多種惡性腫瘤中表達上調，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Twist1可以與E-cadherin的轉錄啟動子E-box結合，抑制E-cadherin的表達，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT。將胰腺癌細胞系放置于缺氧環(huán)境48 h后，Twist1 mRNA表達水平上調[10]。有研究表明轉染Slug的犬腎細胞系高表達血管內皮生長因子（VEGF）和Twist1[11]。在97例肝細胞肝癌樣本中VM陽性組Twist1表達明顯強于VM陰性組，轉染Twist1的HepG2肝癌細胞系E-cadherin表達下調，侵襲和轉移能力增強，并且在體外培養(yǎng)時形成了管腔樣結構[3]。

本實驗通過抑制Caspase 8、9來干擾LPPCN的形成，破壞腫瘤早期微環(huán)境的構建加重腫瘤組織內部缺氧程度，促使腫瘤組織發(fā)生大片壞死，從而下調LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細胞Twist1的表達，其中Caspase 8、9抑制劑聯合組腫瘤細胞核Twist1下調更顯著，LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞核Twist1表達呈遞減趨勢。但LPPCN周圍第1~4層腫瘤細胞漿Twist1表達無遞減趨勢，且VM周圍第1~4層腫瘤細胞核和細胞漿中Twist1表達此種趨勢并不明顯，可能與VM形成后改善腫瘤細胞局部缺氧微環(huán)境有關。實驗表明LPPCN周圍腫瘤細胞在缺氧的誘導下可上調細胞核Twist1表達促使腫瘤細胞發(fā)生EMT，發(fā)生EMT的腫瘤細胞可能在一系列機制的誘導下自分泌多種細胞因子并重塑細胞外基質促使VM的最終形成。

在腫瘤組織快速生長早期，內皮依賴性血管無法滿足腫瘤生長需要，VM的形成對緩解腫瘤細胞局部缺氧微環(huán)境起重要作用。此外，VM形成還有利于腫瘤細胞的侵襲和轉移。單純針對內皮細胞的抗血管生成治療在部分高度惡性腫瘤中沒有達到預期效果，可能與腫瘤組織內存在VM這種獨特的微循環(huán)模式有關。研究VM及其形成機制將有可能為臨床腫瘤抗血管生成治療提供藥物新靶點。

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