張 萌，張?zhí)杖?，周俊飛，安玉會

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 河南鄭州 450052)

Calvo報告，在美國處于骨質(zhì)疏松高風(fēng)險的婦女血中，由于磷酸鈣分解，血磷水平增加［1］。因此認(rèn)為骨質(zhì)疏松病是骨的磷灰石結(jié)晶(磷酸鈣)不斷分解，造成血內(nèi)存在高磷低鈣所致狀況，而且血鈣從尿液排出增加［2］。這一發(fā)現(xiàn)無疑為骨質(zhì)疏松病的防治提供了新的防治戰(zhàn)略。本課題申請者從骨中尋找到一種骨蛋白［3］。它能有效地降低骨質(zhì)疏松病模型大鼠的血磷水平和增加其骨密度［4］。這為骨質(zhì)疏松病的干預(yù)和防治提供了新的技術(shù)手段。本文報告骨蛋白對骨質(zhì)疏松病模型大鼠的尿鈣和尿磷水平的影響。

1 材料和方法

1.1 大鼠地塞米松骨質(zhì)疏松模型的建立 根據(jù)王義生等［5］報告的方法建立骨質(zhì)疏松病大鼠模型。選用60只Wistar大鼠，體重(200±20)g，雌、雄各半，隨機分為6組，即正常對照組(A組)、生理鹽水組(B組)、陽性對照組(C組)、200 mg/kg骨蛋白組(D組)、100 mg/kg骨蛋白組(E組)，50 mg/kg骨蛋白組(F組)，除正常對照組每天每只大鼠灌胃給予2.5 ml生理鹽水外，其它各組每只大鼠按2.5 mg/kg肌肉注射地塞米松，2次/周，連續(xù)注射6周造成骨質(zhì)疏松模型。之后，除A和B組每天每只大鼠灌胃給予5 ml生理鹽水外，C組按300 mg/kg每天每只大鼠灌胃給予接骨七厘片，D、E、F組分別每天每只大鼠灌胃給予200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg的豬骨蛋白。12周后，取尿測尿鈣尿磷和羥脯氨酸含量。

1.2 尿鈣含量測定 尿鈣含量的測定按照鈣試劑盒法測定(試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn))。其測定原理是:在堿性條件下，樣品中的鈣離子與鄰甲酚酞絡(luò)合酮生成紅色絡(luò)合物。其操作步驟是:將試劑l(乙醇胺緩沖液)與試劑2(鄰甲酚酞絡(luò)合酮 0.175 mmol/L，8-羥基喹啉 7.80 mmol/L)等體積混合。鈣標(biāo)準(zhǔn)液:2.5 mmol/L，波長:600 nm，溫度:37℃，比色杯:1 cm直徑。按操作程序加入不同試劑后混勻，保溫5 min，讀取吸光度(A)。計算公式是:鈣含量(mmol/ml)=(A樣品/A標(biāo)準(zhǔn))×2.5 mmol/L(線性上限3.75 mmol/L)。

1.3 尿磷水平測定 尿磷含量測定按照磷試劑盒法測定(試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn))。其測定原理是:在酸性條件下鉬酸銨和血清中的磷反應(yīng)，反應(yīng)生成的未還原磷鉬酸鹽復(fù)合物與樣本中磷的含量成正比。操作步驟是:將試劑l(硫酸23.8 mmol/L，鉬酸銨1.06 mmol/L)13 ml與試劑2(吐溫－80)0.5 ml混合均勻。無機磷標(biāo)準(zhǔn)液1.29 mmol/L。波長:340 nm，比色杯:1 cm直徑，溫度:37℃。按操作程序加入不同試劑后混勻，保溫10 min，讀取吸光度(A)。計算公式是:鈣含量(mmoL/ml)=(A樣品/A標(biāo)準(zhǔn))×1.29 mmol/L(線性上限5.0 mmol/L)。

1.4 尿羥脯氨酸含量測定 尿羥脯氨酸含量測定按照試劑盒法測定(試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。其測定原理是:羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其呈色的深淺可推算其含量。其操作步驟是:將試劑盒中試劑(l～3)按要求配制好待用。將羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水配制成5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。樣本水解:取1 ml尿液準(zhǔn)確加水解液l ml，混勻。放試管中加蓋后，沸水浴水解20 min。將各試管流水冷卻后各管加指示劑1滴，搖勻。各管準(zhǔn)確加入調(diào)pH甲液1.0 ml，混勻(此時溶液應(yīng)為紅色)。各管再逐滴加調(diào)pH的乙液，直至溶液顏色變成黃綠色。此時pH值在6.0～6.8左右。然后加蒸餾水至10 ml，混勻。取3～4 ml稀釋的水解液加適量活性炭，混勻，3 500 r/min離心10 min，小心取上清1 ml作檢測。按試劑盒的操作程序加好試劑后混勻，60℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min離心10 min，取上清液在550 nm處，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度。計算公式是:羥脯氨酸含量(μg/ml)=(測定管吸光度－空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管含量×水解液總體積/(測定管吸光度－空白管吸光度)×取樣量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。數(shù)據(jù)以(s)表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 堿性磷酸酶和骨鈣素水平的測定結(jié)果 見表1。

表1 大鼠尿鈣尿磷和尿羥脯氨酸測定結(jié)果(mmol/L，s)

表1 大鼠尿鈣尿磷和尿羥脯氨酸測定結(jié)果(mmol/L，s)

注:* ，與正常對照組比 P＜0.05;#，，與模型組比 P＜0.05 。

4.95 ±1.62 1.55 ±0.29 5.75 ±1.44模型組(B)6.58 ±1.61* 1.74 ±0.29* 7.28 ±1.35＊＊陽性對照組(C)4.78 ±1.55# 1.52 ±0.30 6.26 ±1.43 200 mg組(D)4.79 ±1.22# 1.65 ±0.28 5.97 ±1.11#100 mg組(E)5.00 ±1.03# 1.72 ±0.27 6.73 ±1.19 50 mg組(F)Ca P HP正常對照組(A)組別6.13 ±1.32 1.62 ±0.29 6.57 ±1.24

3 討論

骨質(zhì)疏松病是以骨密度和骨強度降低，骨脆性增加，易引起骨折，手腳腿抽筋，疼痛的骨衰老性疾?。?］。全球約有2億人患有骨質(zhì)疏松病［7］。中國約有9千萬人患此?。?］。本文作者在先前的研究中已經(jīng)從骨中分離出了1種骨蛋白［3］。用骨蛋白對骨質(zhì)疏松病模型大鼠的干預(yù)防治研究證明，骨蛋白能有效地降低骨質(zhì)疏松病模型大鼠的血磷水平并增加其骨密度［4］，這對于骨質(zhì)疏松病的干預(yù)和防治提供了新的技術(shù)手段。本實驗顯示，骨蛋白能降低骨質(zhì)疏松病模型大鼠的尿鈣水平。這表明當(dāng)患骨質(zhì)疏松病時，骨(磷酸鈣)不斷分解，造成血磷升高。同時，血鈣排入尿液，尿鈣含量增加。骨蛋白能降低血磷水平，但不降低尿磷水平，表明骨蛋白可將血磷帶入骨組織，并與鈣形成磷酸鈣(骨)，增加骨密度。Calvo報告，在美國處于骨質(zhì)疏松高風(fēng)險的婦女血中，由于磷酸鈣分解，血磷水平增加，骨密度降低［1］。這說明降低骨質(zhì)疏松病患者血磷水平和減少尿鈣排出是防治骨質(zhì)疏松病的最關(guān)鍵性環(huán)節(jié)之一。在婦女中，隨著年齡的增加，雌激素分泌逐步減少，使骨的丟失加快，從而引起骨質(zhì)疏松病。雌激素分泌逐步減少可能是婦女患骨質(zhì)疏松病的主要原因。而在老年人身上，骨丟失使其體重丟失明顯［9］。主要原因是25-OH VD和鈣的攝入量不足?？梢?5-OH VD和鈣的攝入量不足是引起骨質(zhì)疏松病的又一關(guān)鍵性因素［10］。25-OH VD和鈣供給不足以及女性雌激素水平的下降，會引起鈣吸收和鈣轉(zhuǎn)運減少，就會導(dǎo)致骨密度降低和骨質(zhì)疏松病的發(fā)生和發(fā)展。因此，補充25-OH VD和鈣，補充骨蛋白和補充植物雌激素可能會獲得更加有效的綜合防治效果。

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