劉 昕

(中國人民解放軍第316醫(yī)院，北京100093)

許多研究已經(jīng)證實(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)與多種疾病相關(guān)，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因，也是亟待解決的臨床難題之一。2010年8月～2011年1月，我們就NF-κB decoy寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞株的耐藥性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥株SW480/阿霉素(ADM)系本實(shí)驗(yàn)室儲存。RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自GIBCO公司，MTT、DMSO及ECL發(fā)光試劑盒購自美國Sigma公司，NF-κB P65抗體及羊抗兔二抗均購自碧云天公司。ADM為日本明治醫(yī)藥公司產(chǎn)品;NF-κB decoy ODNs序列為 5＇-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3＇和 3＇-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5＇，由上海生工合成;Liperfection2000購自invitrigen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SW480貼壁生長于完全培養(yǎng)基(RPMI1640中含10%小牛血清，青霉素和鏈霉素各50 U/L)中，SW480/ADM于完全培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L ADM，并定期添加1 mg/L ADM以維持其耐藥性，兩種細(xì)胞均于37℃、5%CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)，隔天換液，對數(shù)生長期傳代。細(xì)胞分為對照組、SW480組、SW480/ADM組。將各組細(xì)胞按3 000個(gè)/孔種入96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，于12、24、48 h時(shí)取出。檢測時(shí)加入MTT 50μl(1 mg/ml)，培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入100μl二甲基亞砜，脫色搖床20 min搖勻，在570 nm波長檢測吸光度A值，并計(jì)算細(xì)胞的半抑制濃度IC50。

1.3 Western blot檢測核內(nèi) NF-κB 48 h 后，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白，SDS-PAGE膠分離，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶2 500)4℃過夜，TBST漂洗3次后二抗(兔抗羊，1∶2 000)37℃孵育2 h，TBST漂洗后ECL發(fā)光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以±s表示，行單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB decoy的有效性驗(yàn)證 免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)NF-κB decoy處理的SW480/ADM細(xì)胞核內(nèi)染色較對照組明顯降低，提示活化 NF-κB減少，與SW480/ADM組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。Western blot同樣證實(shí)，經(jīng)過NF-κB decoy處理后，核蛋白內(nèi) NF-κB 明顯減少(P ＜0.01)。證明 NF-κB decoy干預(yù)有效。

2.2 NF-κB decoy 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞株耐藥性 按文獻(xiàn)［1］將NF-κB decoy質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，利用MTT檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染不同質(zhì)量(濃度)NF-κB decoy質(zhì)粒后48 h，SW480/ADM的IC50值呈劑量依賴性下降(P＜0.05)。見表1。選取轉(zhuǎn)染 NF-κB decoy質(zhì)粒終濃度為 1 μmol/L，在 12、24、48 h 進(jìn)行檢測，結(jié)果提示隨著時(shí)間延長，自24 h起，NF-κB decoy對耐藥細(xì)胞株的逆轉(zhuǎn)作用與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。見圖1。

表1 不同濃度NF-κB decoy質(zhì)粒對48 h兩種細(xì)胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

表1 不同濃度NF-κB decoy質(zhì)粒對48 h兩種細(xì)胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

mol/L SW480組組別 0 μmol/L 0.1 μmol/L 0.3 μmol/L 1 μ 8.0 ±0.2 7.8 ±2.5 7.1 ±0.9 7.0 ±0.3 SW480/ADM組43.7 ±9.8 37.7 ±6.7 12.2 ±3.9 8.1 ±0.8

圖1 NF-κB decoy不同時(shí)間對SW 480/ADM的耐藥性逆轉(zhuǎn)情況

3 討論

耐藥性又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細(xì)胞對于藥物作用的耐受性，主要是經(jīng)長期或反復(fù)用藥后特別是濫用藥物后產(chǎn)生。耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的治療作用就明顯下降或消失。因此，研究結(jié)腸癌耐藥的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌化療耐藥的新方法，已經(jīng)成為目前結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。NF-κB存在于體內(nèi)多種細(xì)胞中，活化后能與許多基因啟動子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄，參與多種疾病的發(fā)病過程，不僅與細(xì)胞的增殖、凋亡、生長分化、細(xì)胞周期及機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)有關(guān)，而且還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［2～4］。在腫瘤耐藥方面，目前的研究資料認(rèn)為，NF-κB活化后可上調(diào)腫瘤細(xì)胞存活基因的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物所引起的死亡效應(yīng)，從而誘導(dǎo)腫瘤耐藥。NF-κB活性升高是導(dǎo)致結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞多細(xì)胞耐藥的重要原因之一，李建軍等［2］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示其機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

由于NF-κB能特異性識別并結(jié)合目的基因上的κB序列，利用這個(gè)特性，可合成包含κB序列的雙鏈ODNs，將其轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞核，可競爭性結(jié)合核內(nèi)激活的NF-κB，使 NF-κB不能發(fā)揮作用，這一策略也被稱為decoy。NF-κB decoy寡核苷酸已經(jīng)在心血管疾病、炎癥性疾病、器官移植和腫瘤［3，4］的治療研究中都取得了令人滿意的結(jié)果。與使用NF-κB抑制劑如IKKs或IKBs等比較，NF-κB decoy寡核苷酸靶向性更加明確，抑制效果更加專一。本研究采用NF-κB decoy方法使 NF-κB不能發(fā)揮作用，可有效逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株對ADM的耐藥性。但是值得注意的是，由于NF-κB涉及到多個(gè)信號途徑，對腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用僅為其生理功能的一方面，是否有其他方面的影響尚待下一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證。

［1］Yoshizumi T，Ikeda Y，Kanedaand Y.Ex vivo transfer of nuclear factor-κB decoy ameliorates hepatic cold ischemia/reperfusion injury［J］.Transplantation Proceedings，2009，41(5):1504-1507.

［2］李建軍，潘鳳，黃海輝，等.NF-κB信號通路介導(dǎo)結(jié)腸癌多胞耐藥的作用研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，33(10):1205-1208.

［3］De Stefano D，De Rosa G，Carnuccio R.NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12(2):203-213.

［4］Fichtner FS，F(xiàn)uss IJ，Preiss JC，et al.Treatment ofmurine Th1-and Th2-mediated inflammatory bowel disease with NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.J Clin Invest，2005，115(11):3057-3071.