周曉玲 張海 孟憲麗 胡泊洋

（成都中醫(yī)藥大學藥學院藥理教研室，四川 成都610075）

三黃瀉心湯為醫(yī)圣張仲景名方，記載于《金匱要略》，由大黃、黃連和黃芩三味藥組成，全方重在瀉火解毒，清熱燥濕，后世廣泛用于里熱火毒之證，為歷驗不爽之名方［1］。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)大黃－黃芩藥對在實驗中顯示出最強的抗內(nèi)毒素活性，其作用甚至超過了全方，在此基礎(chǔ)上篩選出了瀉心湯有效組分，由黃芩總黃酮與大黃總游離蒽醌配比而成。黃芩總黃酮與大黃總游離蒽醌各配比有一定程度的抑制巨噬細胞分泌NO的作用，并且瀉心湯有效組分能明顯抑制內(nèi)毒素誘導的巨噬細胞炎癥物質(zhì)IL－1β、TNF－α、iNOS mRNA的表達［2］。但是，前期的實驗主要是動物實驗，本實驗從另一個角度，采用細胞培養(yǎng)的方法，建立LPS刺激RAW264.7細胞的炎癥細胞模型，觀察三黃瀉心湯對RAW264.7細胞釋放炎性細胞因子的影響，從而為三黃瀉心湯是否對LPS攻擊產(chǎn)生的膿毒癥具有保護作用以及能否用于臨床膿毒癥的治療提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

大黃游離蒽醌提取物，江蘇省淮安市瑞雷生化制品有限公司；黃芩總黃酮提取物，四川世坤植化有限公司；有效組分為大黃游離蒽醌與黃芩總黃酮按重量比3∶2配伍而成［3］。黃連、黃芩、大黃三味藥均為飲片，購自北京同仁堂成都春熙路北口店，瀉心湯由大黃、黃連、黃芩按2∶1∶1的劑量比組成。

1.1.2 試劑

ELISA試劑盒，R＆D進口分裝；LPS Sigma公司；噻唑藍（MTT），購自Salarbio公司；二甲基亞砜（DMSO），成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；細胞培養(yǎng)液，賽墨飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；胎牛血清，北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 細胞

RAW264.7細胞株購于上海中科院生物科學研究院。

1.1.4 儀器

細胞CO2孵箱（日本SANYO公司，型號：MCO－15AC）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：IX70）；超凈工作臺（蘇州凈化公司，型號：SW－CJ－2F雙人雙面凈化工作臺）；細胞培養(yǎng)板（美國COSTAR公司）；酶標儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞用含10%胎牛血清（FBS）、100U·ml－1青霉素，100U·ml－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞貼壁生長，長滿瓶底80%時，棄去培養(yǎng)液，加入含胰酶消化液1－2ml，消化約2－5min，棄消化液，加入新培養(yǎng)液吹打混懸細胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，加入6.3ml DMEM＋0.7ml FBS，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，隔天換液一次。傳代三次以上，細胞進入對數(shù)生長期，即可用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度三黃瀉心湯對RAW264.7生長活性的影響

取對數(shù)生長期細胞，將濃度為2×105·ml－1的細胞加入96孔板，每孔200μl，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。待細胞融合后，棄上清液。每孔加入100μl DMEM，再加100μl不同濃度的藥物干預培養(yǎng)或無血清DMEM。設(shè)置空白對照組、受試藥物組?？瞻讓φ战M培養(yǎng)液中加入等體積無血清DMEM，受試藥物組加入不同濃度的各受試藥物。每組均設(shè)6個復孔。在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。細胞于培養(yǎng)結(jié)束，加入5mg·ml－1MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸出培養(yǎng)液，并加入150μl DMSO，490nm測定各組的OD值。

1.2.3 三黃瀉心湯對RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響

將濃度為2×105·ml－1的細胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱平衡貼壁24h。待細胞融合后，棄去上清液。重新加入DMEM培養(yǎng)液800μl。每孔加入不同濃度的三黃瀉心湯、三黃瀉心湯有效組分或無血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，加入無血清DMEM培養(yǎng)液100μl。24h后，取細胞上清液200μl，－20℃凍存。

實驗分組及所加試劑：空白組：DMEM＋DMEM；A1組：瀉心湯250μg·ml－1；A2組：瀉心湯50μg·ml－1；A3組：瀉心湯10μg·ml－1；B1組：有效組分50μg·ml－1；B2組：有效組分10μg·ml－1；B3組：有效組分2μg·ml－1。

1.2.4 三黃瀉心湯對LPS刺激的RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響

將濃度為2×105·ml－1的細胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱平衡貼壁24h。待細胞融合后，棄去上清液。重新加入DMEM培養(yǎng)液800μl。每孔加入1μmol·L－1煙堿、不同濃度的三黃瀉心湯和三黃瀉心湯有效組分或無血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，分別加入1μg·ml－1LPS或無血清DMEM培養(yǎng)液100μl。24h后，取細胞上清液200μl，－20℃凍存。

實驗分組及每組所加試劑如下：空白組：DMEM＋DMEM；模型組：DMEM＋LPS；A1組：瀉心湯250μg·ml－1＋ LPS；A2組：瀉心湯50μg·ml－1＋LPS；A3組：瀉心湯10μg·ml－1＋LPS；B1組：有效組分50μg·ml－1＋LPS；B2組：有效組分10μg·ml－1＋ LPS；B3組：有效組分2μg·ml－1＋ LPS。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度三黃瀉心湯對RAW264.7生長活性的影響

采用MTT法檢測不同濃度三黃瀉心湯對RAW264.7生長活性的影響，實驗結(jié)果顯示：1μg·ml－1的LPS，50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黃瀉心湯有效組分和250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的三黃瀉心湯對RAW264.7細胞的生長活性均無影響，見表1、2。

2.2 三黃瀉心湯對RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響

為了排除三黃瀉心湯對正常RAW264.7細胞釋放細胞因子可能的直接作用，我們檢測了不同濃度的三黃瀉心湯對RAW264.7細胞釋放細胞因子的影響。結(jié)果表明：未加三黃瀉心湯時細胞上清中 TNF－α濃度為16.076±0.042pg·ml－1，50、10、2μg· ml－1的三黃瀉心湯有效組分和250、50、10μg·ml－1的三黃瀉心湯對RAW264.7細胞釋放炎性細胞因子均無影響，見表3。

表1 瀉心湯對raw264.7細胞生長活性的影響（±s，n＝6）

表1 瀉心湯對raw264.7細胞生長活性的影響（±s，n＝6）

組別 濃度（μg·ml－1） OD值空白組2.033±0.108瀉心湯 A1 250 2.108±0.171瀉心湯 A2 50 2.044±0.123瀉心湯－A3 10 1.929±0.124

表2 瀉心湯有效組分對raw264.7細胞生長活性的影響（±s，n＝6）

表2 瀉心湯有效組分對raw264.7細胞生長活性的影響（±s，n＝6）

組別 濃度（μg·ml－1） OD值空白組B3 2 1.504±0.182 1.504±0.182瀉心湯有效組分B1 50 1.554±0.166瀉心湯有效組分B2 10 1.651±0.203瀉心湯有效組分－

2.3 三黃瀉心湯對LPS刺激的RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響

模型組與空白組比較，模型組TNF－α含量顯著增加，達到753.021pg· ml－1（P＜0.01）。 同 模 型 組 比 較，50、10、2μg·ml－1的有效組分組TNF－α受到不同程度的抑制，但是250、50、10μg·ml－1的瀉心湯組 TNF－α濃度與模型組無顯著性差異，見表3。

3 討論

內(nèi)毒素血癥（Intestinal end toxemia，IETM）是由于血中細菌或病灶內(nèi)細菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸人大量內(nèi)毒素污染的液體而引起，分為內(nèi)源性和外源性兩種，其進一步發(fā)展可能引起全身炎癥反應綜合征（SIRS）或多功能器官衰竭（MODS）的發(fā)生而導致死亡［4］。其作用機制是LPS進入機體后，大部分與血漿LPS結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）結(jié)合，形成復合體轉(zhuǎn)運給單核巨噬細胞膜表面的受體CDl4分子，LPS的信號傳遞需借助膜上的另一個受體TLR4（Toll like receptor 4）發(fā)揮內(nèi)毒素的生物學作用，TLR4在輔助受體CD12的幫助下，經(jīng)過一系列生化反應，最后激活核因子AP－1和NF－κB。AP－1和NF－κB可介導機體產(chǎn)生多種生物活性分子，如腫瘤壞死因子（TNF－a）、HMGB1、白細胞介素（IL）等肽類物質(zhì)，白三烯等脂類介質(zhì)及一氧化氮等，導致肝臟和其他臟器受損［5］。

表3 三黃瀉心湯對LPS刺激和未刺激的RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響（±s，n＝6）

表3 三黃瀉心湯對LPS刺激和未刺激的RAW264.7釋放炎性細胞因子的影響（±s，n＝6）

注：與模型組比較，＊＊p＜0.01。

TNF－α（pg·ml－1）刺激空白組別 濃度（μg·ml－1）LPS未刺激 LPS 16.076±0.042 22.326±0.992模型 － － 753.021±106.768瀉心湯 A1 250 23.388±2.467 694.732±49.347瀉心湯 A2 50 24.928±2.359 711.843±94.785瀉心湯 A3 10 21.384±5.927 710.151±47.403瀉心湯有效組分B1 50 23.053±6.519 704.299±43.433瀉心湯有效組分B2 10 18.120±0.749 536.479±47.664＊＊瀉心湯有效組分B3 2 19.886±5.079 535.394±74.399－＊＊

腫瘤壞死因子在內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生的各種細胞因子中，起著關(guān)鍵性作用。有人認為在內(nèi)毒素刺激下，TNF－α首先產(chǎn)生、釋放增加，激發(fā)細胞因子網(wǎng)絡(luò)，造成細胞因子級聯(lián)反應，誘發(fā)其他炎癥介質(zhì)，從不同環(huán)節(jié)參與體內(nèi)炎癥反應，引起多器官組織損傷［6］。因此，在本實驗研究中，我們首先選取TNF－α為監(jiān)測指標。而三黃瀉心湯對LPS刺激的其他炎癥因子和抗炎因子的作用在以后的實驗過程中將進一步研究。

本研究參照其他實驗室的經(jīng)驗，根據(jù)具體實驗最終選擇LPS 1μg·ml－1刺激細胞建立炎癥細胞模型。為了排除三黃瀉心湯對RAW264.7細胞因子釋放的抑制作用是其細胞毒作用所致，我們觀察了不同濃度三黃瀉心湯對RAW264.7細胞活力的影響。實驗結(jié)果顯示三黃瀉心湯有效組分可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7細胞釋放TNF－α，各個濃度的三黃瀉心湯對細胞活力無明顯影響，顯示其影響細胞因子釋放作用與細胞毒作用無關(guān)，為三黃瀉心湯能否用于臨床膿毒癥的治療提供了一定的理論依據(jù)。

實驗結(jié)果顯示50μg·ml－1比10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黃瀉心湯有效組分對LPS刺激的RAW264.7釋放TNF－α的抑制作用弱，這可能與藥物作用機制有關(guān)。實驗中觀察到50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的有效組分組 TNF－α受到不同程度的抑制，但是250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的瀉心湯組TNF－α濃度與模型組無顯著性差異。這可能與瀉心湯在給藥前的處理過程有關(guān)，我們將進一步對處理前與處理后三黃瀉心湯的化學成分與含量進行檢測，探索其原因。

1 張保偉，劉渡舟.《金匱要略》瀉心湯諸問淺識［J］.中醫(yī)函授通訊，2000，19（5）：15－16.

2 孟憲麗，熊玉霞，楊娜，等.瀉心湯有效組分配伍對脂多糖誘導的大鼠腹腔巨噬細胞活化的影響［J］.中藥藥理與臨床，2007，23（5）：27－30.

3 熊玉霞，孟憲麗，楊娜，等.瀉心湯有效組分及其配伍配比對大鼠腹腔巨噬細胞釋放一氧化氮的影響［J］.中藥材，2007，1（30）：66－69.

4 Wichmann WM，Inthorn D，Andress HJ，et al.Incidence and mortality of sever sepsis in surgical intensive care patients：the influence of patient gender on disease process and outcome［J］.Intensive Care Med，2000，26（2）：167－172.

5 Shimazu R，Akashi S，Ogata H，et al.MD－2，a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll－like receptor 4［J］.J Exp Med，1999，189（11）：1777－1782.

6 Cavaillon JM，Adib－Conquy M，F(xiàn)itting C，et al.Cytokine cascade in sepsis［J］.Scand J Infect Dis，2003，35（9）：535－544.