張毅哲，劉 瓊，田 靜，邵永紅

1)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060;2)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，深圳518060

硒是生物體必需的微量元素，缺硒會(huì)誘發(fā)許多重大疾病［1］，補(bǔ)硒能降低克山病和大骨節(jié)病發(fā)病率.硒對(duì)阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)、精神分裂癥和認(rèn)知能力等也有影響［2-5］.將硒用于缺硒大鼠，可維持其大腦硒水平，優(yōu)先供給中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2-4］.硒在腦內(nèi)的生物功能主要通過(guò)各種硒蛋白實(shí)現(xiàn)，硒蛋白對(duì)維護(hù)腦的生長(zhǎng)發(fā)育和預(yù)防腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有重要作用［5］.脫碘酶(iodothyronine deiodinases，DIO)是哺乳動(dòng)物大腦中的一種重要硒蛋白，它在大腦中的生物功能及作用機(jī)制目前尚不清楚.脫碘酶3(DIO3)為3種類(lèi)型脫碘酶中的一種［6］，是使三碘甲狀腺原氨酸(T3)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)失活的主要脫碘酶［7］.因此篩選人腦中與DIO3相互作用的蛋白，探索DIO3作用途徑及生物功能，有助于揭示硒預(yù)防腦疾病的分子機(jī)理.

DIO3具有硒蛋白基因結(jié)構(gòu)特征，即其活性中心的重要氨基酸硒代半胱氨酸 (selenocysteine，Sec)由傳統(tǒng)終止碼TGA編碼.為使DIO3能在酵母中表達(dá)，需將該TGA碼突變?yōu)榫幋a半胱氨酸(cysteine，Cys)的密碼子，把基因突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響降到最低.本研究采用酵母雙雜交技術(shù)，以DIO3基因截短突變體為“誘餌”，篩選人胎腦cDNA文庫(kù)，尋找人腦中與其相互作用的蛋白，并用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法 (fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)進(jìn)行驗(yàn)證.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和材料

Matchmaker Y2HGold酵母雙雜交系統(tǒng)及人胎腦cDNA文庫(kù)，酵母缺陷型氨基酸SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Ade/-Trp/-Leu、SD/-Ade/-His3/-Trp/-Leu混合物，X-α-Gal和 抗 真 菌抗 生 素 Aureobasidin A(AbA)均購(gòu)自Clontech公司;人DIO3基因突變體、HEK293T細(xì)胞和Top10大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存;DNA限制性?xún)?nèi)切酶、Taq酶和T4 DNA高效連接試劑盒購(gòu)自Takara公司;酵母提取物、瓊脂粉和酵母培養(yǎng) (yeast nitrogen base without amino acids，YNB)基本氮源購(gòu)自Difco公司;蛋白胨、3-氨基-1，2，4- 三唑和 212 ～300 μm 玻璃珠購(gòu)自 Sigma公司;Tris和PEG3350購(gòu)自Merck公司;pECFP-C1載體 (cyan fluorescent protein，CFP)和pEYFP-C1載體 (yellow fluorescent protein，YFP)由深圳大學(xué)田生禮副教授惠贈(zèng);DNA-MATE轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自深圳博納泰克公司.主要儀器有共聚焦顯微鏡專(zhuān)用培養(yǎng)皿 (直徑35 mm，Merck公司)、共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1000)和PCR儀 (廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司，2720型).

1.2 人DIO3基因突變體的克隆及質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù) DIO3基因(NM_001362.3)的編碼序列(837堿基對(duì) (base pair，bp))，以購(gòu)自Gibco公司的成人肝cDNA文庫(kù)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增人DIO3全基因，克隆后測(cè)序驗(yàn)證讀碼框準(zhǔn)確性.以DIO3全基因?yàn)槟０?，采用重疊PCR技術(shù)，使DIO3基因中TGA碼突變?yōu)門(mén)GC碼，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框準(zhǔn)確性.將經(jīng)DNA限制性?xún)?nèi)切酶SfiⅠ酶切后的DIO3突變截短體，用T4連接酶鏈接到NpGBKT7載體上，

獲得誘餌質(zhì)粒 NpGBKT7-DIO3.把 NpGBKT7-DIO3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Top 10中，用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆.

1.3 酵母轉(zhuǎn)化

挑取酵母菌3～4個(gè)克隆 (菌落直徑2～3 mm)，接種于液體酵母完全培養(yǎng)基 (yeast peptone dextrose adenine，YPDA)中，30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h至 OD600≥1.5.利用 PEG/LiAc法制備新鮮的酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參見(jiàn)Clontech公司酵母操作手冊(cè);轉(zhuǎn)入已構(gòu)建好的誘餌蛋白質(zhì)粒0.1 mg，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 (分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pGBKT7-p53和pADT7-T)和陰性對(duì)照 (分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 pGBKT7-Lam和pADT7-T).用200 μL雙蒸水重懸酵母細(xì)胞，鋪在缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上 (直徑90 mm)，同時(shí)將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組鋪于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d，得到酵母誘餌菌株NpGBKT7-DIO3.將試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照組比較，通過(guò)酵母生長(zhǎng)狀態(tài)和酵母菌落是否變藍(lán)排除試驗(yàn)組的自激活作用.

1.4 文庫(kù)篩選

挑選在 SD/-Trp/X-α-Gal的 AbA固體培養(yǎng)基(含抗真菌抗生素)上生長(zhǎng)的含有NpGBKT7-DIO3質(zhì)粒的酵母菌落 (直徑＞2 mm)，接種于50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 ～18 h，至 OD600＞1.5.再轉(zhuǎn)移至 300 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6.采用PEG/LiAc/TE法，轉(zhuǎn)入文庫(kù)質(zhì)粒50 μg.鋪在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)1周.

1.5 酵母細(xì)胞內(nèi)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

從 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA 固體培養(yǎng)基平板上挑取陽(yáng)性克隆(菌落直徑＞2 mm)，接種于5 mL SD/-Leu液體培養(yǎng)基，30℃、250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，從酵母中提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Top10中，用含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基篩選，并提取質(zhì)粒(載體為pACT2)，再與NpGBKT7-DIO3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)Y2HGold酵母細(xì)胞，鋪在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀(guān)察菌落是否變藍(lán).對(duì)篩選變藍(lán)的菌落所轉(zhuǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定所篩選基因的名稱(chēng)、歸屬、同源相似率、啟始碼、終止碼和編碼區(qū)等基因相關(guān)信息.

1.6 FRET技術(shù)驗(yàn)證

重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以質(zhì)粒NpGBKT7-DIO3和pACT2-SERPINA3為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的兩段基因分別經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，純化回收后分別用T4連接酶連接到質(zhì)粒pECFP-C1和pEYFP-C1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pECFP-C1-DIO3截短突變體和pEYFP-C1-SERPINA3截短體，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確.

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按2×105/孔接種HEK 293T細(xì)胞至共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)單轉(zhuǎn)pECFP-C1-DIO3截短突變體，單轉(zhuǎn)pEYFP-C1-SERPINA3截短體，共轉(zhuǎn)染pECFP-C1-DIO3截短突變體和pEYFP-C1-SERPINA3截短體.以單轉(zhuǎn) pECFPC1、單轉(zhuǎn)pEYFP-C1及共轉(zhuǎn)pECFP-C1和pEYFP-C1為對(duì)照組.具體方法為:將DNA及轉(zhuǎn)染試劑溶液混合，室溫孵育30 min;將小皿中培養(yǎng)基換用2 mL無(wú)抗無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染混合液并輕柔混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中 (37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%)孵育;4 h后棄去培養(yǎng)基，換用含10%小牛血清的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)繼續(xù)培養(yǎng).

敏化發(fā)射 (sensitized emission)法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，取培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，分別以405 nm(檢測(cè)供體pECFP-C1的青色熒光)和515 nm(檢測(cè)受體pEYFP-C1的黃色熒光)為激發(fā)波長(zhǎng)，在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察融合蛋白pECFP-C1-DIOⅢ截短突變體和 pEYFP-C1-SERPINA3截短體的共定位表達(dá).采用 FV10-ASW 2.1 Viewer軟件，計(jì)算FRET效率E、供體與受體之間的距離D.pECFP-C1-DIOⅢ截短突變體和pEYFPC1-SERPINA3 的 Foster距離 R0=5.276 7μm.

熒光壽命法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)熒光壽命法分別測(cè)定pECFP與pEYFP共轉(zhuǎn) HEK293T，pECFP-DIO3'與 pEYFP-SERPINA3共轉(zhuǎn)HEK293T，兩組樣品的熒光壽命.采用激光共聚焦顯微鏡、405 nm激光器、TCSPC采集卡及其配套SPC采集軟件和圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和相關(guān)數(shù)據(jù)的分析與計(jì)算.

2 結(jié) 果

2.1 DIO3基因片段的克隆與測(cè)序

由于DIO3基因中有一個(gè)硒代半胱氨酸，正常情況下會(huì)導(dǎo)致翻譯終止，要想得到真正具有生物活性的DIO3蛋白質(zhì)，并利用酵母雙雜交技術(shù)研究其相互作用，必須將硒代半胱氨酸突變成半胱氨酸.同時(shí)，由于DIO3基因全長(zhǎng)的N端有一段跨膜結(jié)構(gòu)域，而這段區(qū)域會(huì)阻礙酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，因此不擴(kuò)增此區(qū)域，最終獲得DIO3突變截短體基因片段，大小為729 bp.將隨意挑選的 NpGBKT7-DIO3突變截短體重組質(zhì)粒使用sfiⅠ限制性?xún)?nèi)切酶50℃酶切3 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在729 bp處有目的條帶出現(xiàn) (圖1)，證明目的質(zhì)粒構(gòu)建成功.測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增的目的基因片段序列與已報(bào)道序列完全匹配，編碼框中編碼硒代半胱氨酸的TGA碼被突變?yōu)榫幋a半胱氨酸的TGC碼.

圖1 DIO3基因片段重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Enzymatic digestion of the recombinant plasmid NpGBKT7-DIO3

2.2 共轉(zhuǎn)法篩選人胎腦cDNA文庫(kù)

應(yīng)用PEG/LiAc法分別將NpGBKT7-DIO3突變截短體與NpADT7空載共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌空載涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA平板，轉(zhuǎn)化后2 d菌落生長(zhǎng)飽滿(mǎn).根據(jù)與陽(yáng)性對(duì)照組平板、陰性對(duì)照組平板的比較，NpGBKT7-DIO3突變截短體與pADT7空載共轉(zhuǎn)化的酵母菌落顏色為白色，而陽(yáng)性對(duì)照組平板上生長(zhǎng)的酵母菌落為藍(lán)色，且NpGBKT7空載單轉(zhuǎn)的酵母菌落為白色，通過(guò)對(duì)比可知NpGBKT7-DIO3突變截短體本身沒(méi)有自激活現(xiàn)象.

采用PEG/LiAc法共轉(zhuǎn)pGBKT7-DIO3突變截短體質(zhì)粒(100 μg)和Clontech人胎腦cDNA文庫(kù)質(zhì)粒(50 μg)進(jìn)入Y2HGold酵母菌中，鋪于直徑150 mm的 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上，培養(yǎng)7 d后，在板上有較大的菌落長(zhǎng)出，見(jiàn)圖2.

圖2 人胎腦cDNA文庫(kù)中與DIO3突變截短體相互作用的蛋白的篩選平板圖Fig.2 Screening the interactive protein of DIO3 from human fatal brain cDNA library

挑選圖2中的6號(hào)菌落，提取分離其中的AD質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序，并在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，獵物基因?yàn)槿私z氨酸蛋白酶抑制劑A族蛋白3(Homo sapiens serpin peptidase inhibitor，clade A，member 3，SERPINA3)，基因登記號(hào)為 NM_001085.4.

2.3 回轉(zhuǎn)酵母驗(yàn)證篩選所得蛋白相互作用

將NpGBKT7-DIO3突變截短體質(zhì)粒和分離出來(lái)的pACT2-SERPINA3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)進(jìn)Y2HGold酵母菌中;同時(shí)用pGBKT7-p53和pADT7-T共轉(zhuǎn)Y2HGold酵母菌作為陽(yáng)性對(duì)照;用pGBKT7-Lam和pADT7-T共轉(zhuǎn)酵母菌作為陰性對(duì)照.鋪板3 d后，共轉(zhuǎn)NpGBKT7-DIO3和pACT2-SERPINA3的一組以及陽(yáng)性對(duì)照組在 SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上有較大的藍(lán)色菌落長(zhǎng)出，而陰性對(duì)照組的菌落小且沒(méi)有變藍(lán)，說(shuō)明DIO3突變截短體和SERPINA3之間確實(shí)存在相互作用，見(jiàn)圖3.

圖3 酵母細(xì)胞內(nèi)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證DIO3突變截短體與SERPINA3的相互作用Fig.3 Verification of DIO3 and SERPINA3 interaction by co-transformation of the two gene fragments into yeast cells

2.4 FRET技術(shù)驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用

敏化發(fā)射法檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用 為在活體細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，將DIOⅢ突變截短體插入熒光蛋白表達(dá)載體pECFP-C1中，SERPINA3插入熒光蛋白表達(dá)載體pEYFP-C1中，構(gòu)建CFP和YFP標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)載體pECFP-C1-DIOⅢ'和pEYFP-C1-SERPINA3截短體.

將 pECFP-C1-DIOⅢ'(5 μg)和pEYFP-C1-SERPINA3截短體分別單轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞;再將上述兩質(zhì) 粒 以 質(zhì) 量 比 1∶1(均 為 2.5 μg) 共 轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞，共3個(gè)樣品，轉(zhuǎn)染24 h后，在共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行FRET檢測(cè).采集圖像前，在顯微鏡下找到熒光表達(dá)適度的細(xì)胞，用固定的成像參數(shù)對(duì)其分別進(jìn)行CFP通道和YFP通道成像.固定的成像參數(shù)設(shè)置如下:CFP通道，7%激光功率，HV為400;YFP通道，7%激光功率，HV為400.依據(jù)敏化發(fā)射方法要求，分別利用3個(gè)樣品采集7張圖像，以單轉(zhuǎn)CFP空載、單轉(zhuǎn)YFP空載、共轉(zhuǎn)CFP空載和YFP空載的樣品作為陰性對(duì)照組，選取了10個(gè)不同的感興趣區(qū)域 (region of interest，ROI)進(jìn)行測(cè)定.

根據(jù)FRET敏化發(fā)射法原理，如果代表供體和受體的兩個(gè)熒光蛋白間存在相互作用，蛋白間距離應(yīng)在10 nm之內(nèi).通過(guò)采集以下7張圖 (圖4)，可計(jì)算蛋白質(zhì)之間的距離及熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率.陰性對(duì)照組也同樣采集上述7張圖，單轉(zhuǎn)質(zhì)粒分別為不含相互作用蛋白基因片段的相應(yīng)熒光蛋白載體，即pECFP-C1空載單轉(zhuǎn)細(xì)胞、pEYFP-C1空載單轉(zhuǎn)細(xì)胞、pECFP-C1和pEYFP-C1空載共轉(zhuǎn)細(xì)胞.采用FV10-ASW 2.1 Viewer軟件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的原始數(shù)據(jù)，計(jì)算得出 pECFP-C1-DIOⅢ截短突變體與pEYFP-C1-SERPINA3截短體間的能量轉(zhuǎn)移率和作用距離.

圖4 FRET敏化發(fā)射法驗(yàn)證DIOⅢ與SERPINA3的相互作用Fig.4 Verification of the interaction between DIOⅢand SERPINA3 proteins by the method of sensitized emission of FRET

表1列出了所選取的10個(gè)不同ROI中測(cè)定的E和D.由表1可算出FRET平均效率E=23.4%，蛋白間的距離 D=6.632 nm.結(jié)果表明，pECFPC1-DIOⅢ截短突變體和pEYFP-C1-SERPINA3截短體在細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，證明DIOⅢ截短突變體與SERPINA3截短體確實(shí)存在相互作用.

表1 不同細(xì)胞的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率和蛋白間的距離Table1 The FRET efficiency and the distance between two interactive proteins

熒光壽命法檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用 為了在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)是否存在上述蛋白質(zhì)相互作用，將DIO3突變截短體插入熒光蛋白表達(dá)載體pECFP-C1，將SERPINA3插入熒光蛋白表達(dá)載體pEYFP-C1中，構(gòu)建了CFP和 YFP標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)載體pECFP-C1-DIO3和 pEYFP-C1-SERPINA3截短體.采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的熒光壽命法測(cè)定pECFP-C1與 pEYFP-C1共轉(zhuǎn)化 HEK293T細(xì)胞、pECFP-DIO3突變截短體與pEYFP-SERPINA3共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，利用TCSPC采集卡配套的一個(gè)SPC采集軟件，一個(gè)SPC image分析軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析與計(jì)算.圖5為任意選取的一對(duì)陰性對(duì)照組和相互作用蛋白組的熒光壽命檢測(cè)曲線(xiàn).對(duì)照組與蛋白相互作用驗(yàn)證組的細(xì)胞均選取10個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)細(xì)胞選取至少8個(gè)ROI.表2列出任意選取的8個(gè)ROI的熒光壽命值 (tm).表2列出圖5中任意選取的8個(gè)ROI的tm.由圖5和表2的熒光壽命值可見(jiàn)，共轉(zhuǎn)DIO3突變截短體與SERPINA3的細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比較，熒光壽命衰減的更快，說(shuō)明DIO3突變截短體與SERPINA3間具有相互作用.

圖5 基因轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞的熒光壽命衰減曲線(xiàn)Fig.5 The decay curves of the fluorescence lifetime in the gene-transfected HEK293T cells

表2 DIO3突變截短體與SERPINA3共轉(zhuǎn)細(xì)胞后不同ROI的熒光壽命值Table 2 The fluorescence lifetime of cells co-transfected with DIO3 and SERPINA3 genes 單位:ps

3 討論

本研究采用酵母雙雜交技術(shù)和FRET技術(shù)篩選和初步驗(yàn)證了與DIO3突變體相互作用的蛋白為SERPINA3.DIO3突變體中用 Cys取代了硒蛋白DIO3中的Sec，由于Cys和Sec的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)均十分相近，因此能最大程度降低基因突變對(duì)蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的改變.

SERPINA3是糖基化的絲氨酸蛋白酶抑制劑.有研究表明SERPINA3能加速Aβ原纖維的解聚，從而在機(jī)體內(nèi)形成炎癥反應(yīng)導(dǎo)致 Aβ的聚集［8-9］.SERPINA3充當(dāng)分子伴侶的角色，能夠增加Aβ的神經(jīng)毒性，促使淀粉樣蛋白絲的形成.轉(zhuǎn)基因小鼠模型也證實(shí)SERPINA3既能夠抑制Aβ的降解同時(shí)又能夠促進(jìn)Aβ在腦中的聚集［10］.近年大規(guī)?；蚪M研究顯示，SERPINA3的等位基因突變與AD及年齡依賴(lài)性神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)［11-12］.因此，SERPINA3與AD關(guān)系密切.

有報(bào)道稱(chēng)［5］，缺硒直接導(dǎo)致老年人認(rèn)知功能降低.DIO3是腦中主要表達(dá)的一種硒蛋白，對(duì)腦的發(fā)育十分重要［6］，而硒對(duì)AD的作用途徑目前尚不清楚.本研究結(jié)果表明，DIO3與SERPINA3的相互作用.DIO通常用活性中心的硒與含巰基的抑制劑發(fā)生作用［13］，而SERPINA是絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑［14］，因此推斷DIO3與 SERPINA3的相互作用可能與脫碘酶上的硒醇基 (或突變體上的巰基)及SERPINA3涉及的絲氨酸和半胱氨酸相關(guān)聯(lián).然而真實(shí)作用機(jī)制有待今后深入研究，對(duì)上述蛋白質(zhì)相互作用的認(rèn)識(shí)將有助于揭示硒和DIO3在A(yíng)D形成過(guò)程中的重要作用.

致謝:衷心感謝倪嘉纘院士對(duì)本實(shí)驗(yàn)整體方案設(shè)計(jì)的悉心指導(dǎo)!

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