曹 鵬 李金強 梁君妮 沙美蘭 關(guān)麗麗 牟妍

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局 山東煙臺 264000;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院)

1 前言

二氨基酚類作為廣泛使用的精細化工中間體，主要應(yīng)用于醫(yī)藥、染料、橡膠、石油、農(nóng)藥等行業(yè)。它是一種危害嚴重的化合物，可誘導(dǎo)DNA斷裂而具有遺傳毒性，即使在很低的濃度下也可產(chǎn)生基因突變，具有致癌性，且很難自然降解。

氧化型染發(fā)劑(又稱持久性染發(fā)劑)以其染色效果好、色調(diào)變化寬、維持時間長等諸多優(yōu)點而成為最受歡迎的染發(fā)劑，在歐洲和美國約占到市場分額的80%，其主要由氧化型染料和氧化劑組成，使用前混勻，在頭發(fā)中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色。作為氧化型染料，2，4－二氨基苯酚及其鹽和2，3－二氨基苯酚被用于氧化型染發(fā)劑中，歐盟和我國都規(guī)定了其最大使用濃度不得超過10%;而2，4－二氨基苯甲醚及其鹽，因其具有致敏性和致癌性，會對人體健康造成多種急性或慢性的損害，所以被歐盟和中國列為禁用物質(zhì)［1－4］。

目前，關(guān)于染發(fā)劑中氧化型染料的測定方法，應(yīng)用最多的是液相色譜法［5－10］和氣相色譜－質(zhì)譜法［11－14］，此外還有應(yīng)用氣相色譜法［15，16］、液相色譜－質(zhì)譜法［17，18］的報道，主要是圍繞染發(fā)劑中的苯二胺類及某些酚類化合物進行測定，而有關(guān)二氨基酚類化合物的檢測較少。

本研究采用添加抗氧化劑的甲酸水溶液提取樣品，正己烷凈化，經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)分離后，采用紫外檢測器對樣品中2，4－二氨基苯酚鹽酸鹽、2，3－二氨基苯酚和2，4－二氨基苯甲醚鹽酸鹽進行檢測，建立了染發(fā)劑中3種二氨基酚類化合物同時提取、同時檢測的高效液相色譜定性、定量方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑和材料

除另有規(guī)定外，試劑均為液相色譜純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

甲醇、乙腈、甲酸、正己烷、抗壞血酸：均為優(yōu)級純;

庚烷磺酸鈉、檸檬酸：分析純;

2，4 －二氨基苯酚鹽酸鹽(≥99.0%)，2，4 －二氨基苯甲醚鹽酸鹽(≥99.0%)，2，3－二氨基苯酚(≥97.0%)，均為 Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

0.2%庚烷磺酸鈉水溶液(PH=3)：稱取2.0 g庚烷磺酸鈉，用水溶解并定容至1000 mL，檸檬酸調(diào)節(jié)PH值=3;

0.1%甲酸甲醇溶液：稱取0.2 g抗壞血酸，加入1 mL甲酸，用甲醇定容至1 L;

0.1%甲酸水溶液：稱取0.2 g抗壞血酸，加入1 mL甲酸，用水定容至1 L;

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，以0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度;2，3－二氨基苯酚需采用差量法稱取5mg溶解，儲備液保存于4℃冰箱中，1周內(nèi)使用;

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至棕色容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋成適用濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配有紫外－可見檢測器或二極管陣列檢測器(美國);超純水儀：Milli－Q Gradient(法國);高速離心機：TGL－10C(上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲波提取儀：KQ－600E(昆山市超聲儀器有限公司);漩渦混合器：FJ200－S(上海標(biāo)本模型廠)。

2.2 方法

2.2.1 樣品的前處理

稱取0.010 g試樣(精確至0.0001 g)于10 mL離心管中，迅速加入5 mL0.1%甲酸水提取液及5 mL正己烷，渦旋1 min，超聲5 min，再渦旋1 min，5000 r/min離心5 min，棄去上層;再次加入5 mL正己烷，渦旋1 min，5000 r/min離心1 min，吸取下層水相過0.22 μm濾膜，供液相色譜測定。

2.2.2 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6 mm ×250 mm，5μm);流速：1.0 mL/min;進樣體積：20 μL;柱溫：30℃;檢測波長：286nm;流動相：A 為0.2%庚烷磺酸鈉水溶液(檸檬酸調(diào)PH=3)，B為乙腈，C為甲醇;梯度洗脫程序見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

二氨基酚類曝露在空氣中很容易被氧化，所以在配制標(biāo)準(zhǔn)品的過程中應(yīng)添加適合的抗氧化劑。由于后期檢測需用紫外檢測器，因此選擇分子量小、對紫外檢測器無干擾的抗壞血酸作為抗氧化劑。

3.2 樣品提取和凈化條件的選擇

因二氨基酚類分子極性較強，易溶于水，降低提取液PH值可以增加其在水相的溶解度，減少在有機相中的分配比，同時提取液中添加一定的抗壞血酸作為抗氧化劑，也不會對色譜造成損害和污染。因此，最終采用含0.1%甲酸、0.02%抗壞血酸(L－Ascorbic acid)的去離子水作為提取溶液。

氧化型染發(fā)劑一般為二劑型，其中著色劑基本處于不穩(wěn)定狀態(tài)，在遇熱、水介質(zhì)、暴露空氣等情況下均易氧化，變質(zhì)失效，導(dǎo)致實際檢測值與樣品中的含量不符合。因此，產(chǎn)品配方中均含有輔加劑，主要由穩(wěn)定劑(抗氧化劑)、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑以及高碳醇等組成，且大部分輔加劑可在正己烷－水相萃取體系中形成乳化層而去掉。由圖1可以看出，凈化效果完全可以滿足液相色譜的檢測需求。

圖1 樣品凈化前后的液相色譜圖

3.3 色譜柱和流動相的選擇

3種物質(zhì)中除了2，4－二氨基苯甲醚鹽酸鹽，其它2種在苯環(huán)上帶有氨基和羥基，屬于兩性物質(zhì)，極性較強、揮發(fā)性低，且檢測時受基質(zhì)影響嚴重。由于其難以被普通反相柱保留，因此，在建立液相分離條件時比較了ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6 mm ID ×250 mm，5 um)、ZORBAX Eclipse XDB －C18(4.6 mm ID ×250 mm，5 um)、LiChrospher 100 NH2(4.6 mm ID ×250 mm，5um)、Synergi MAX －RP 80A(4.6 mm ID ×250 mm，4 um)，觀察4種色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用ZORBAX E-clipse Plus C8色譜柱，3種物質(zhì)得到了基線分離，而且峰形得到了很大的改善。

為了優(yōu)化流動相，使用了乙腈+水、甲醇+水、乙腈+0.1%甲酸水、甲醇+0.1%甲酸水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜峰分離度較差，拖尾比較嚴重，這是因為二氨基酚類在水中解離后呈弱堿性，在反相柱上可與未封端的硅醇基相互作用，導(dǎo)致峰型拖尾;使用強酸性的離子對試劑與其作用生成帶烷基鏈的中性分子，可增加其在反相柱上的保留并改善峰性;最后使用甲醇+乙腈+庚烷磺酸鈉/檸檬酸水溶液時(比例見表1)，得到了較好的分離度和色譜峰。

選擇上述色譜柱和流動相進行分析，典型的液相色譜圖見圖2。

圖2 3種二氨基酚類混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3.4 方法的線性范圍與檢出限

稱取3種二氨基酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并用空白基質(zhì)溶液稀釋成 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列工作溶液，以本標(biāo)準(zhǔn)的測試條件，每次進樣20 μL進行測定。以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明各組分皆能保持良好的線性關(guān)系。以S/N=3所對應(yīng)的被測化合物的含量作為方法的檢出限(LOD)，以S/N=10所對應(yīng)的被測化合物的含量作為方法的定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。

表2 3種二氨基酚類化合物的線性方程、檢出限、定量下限

3.5 回收率與精密度

以不含二氨基酚類化合物的氧化型染發(fā)劑為研究對象，分別加入不同濃度的混合標(biāo)樣，每組做6個平行樣品，進行回收率和精密度實驗。結(jié)果(見表3)顯示，目標(biāo)化合物的回收率為76.0% －109.8%，RSD為0.8% －7.9%，說明方法精密度良好，符合殘留分析的要求?？瞻兹景l(fā)劑樣品色譜圖和添加量為100 mg/kg的染發(fā)劑樣品色譜圖見圖3、圖4。

表3 方法的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 空白樣品的高效液相色譜圖

圖4 加標(biāo)樣品的高效液相色譜圖

4 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜儀，建立了染發(fā)劑中3種二氨基酚類化合物殘留檢測方法。在所選的實驗條件下，3種化合物用ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱分離后，采用二極管陣列檢測器進行定性及定量分析。方法具有靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度好的特點，適合于染發(fā)劑中二氨基酚類化合物的檢測。

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