馬育松 葛 娜 郭春海 段文仲 陳瑞春

(1.河北出入境檢驗檢疫局 河北石家莊 050051;2.秦皇島出入境檢驗檢疫局)

1 前言

地塞米松(Dexamethasone，簡寫為DEX)，學(xué)名9α －fluoro－11β，17α，21－trihydroxy－16α －methylpregna－1，4－diene－3，20 －dione，是人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素類藥物。DEX純品為白色或近乎白色的結(jié)晶性粉末，無嗅，味苦，幾乎不溶于水，溶于甲醇。

DEX具有抗炎及抗過敏作用，能抑制結(jié)締組織的增生，降低毛細(xì)血管壁和細(xì)胞膜的通透性，減少炎性滲出，并能抑制組織胺及其他毒性物質(zhì)的形成與釋放，還能促進蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)變?yōu)樘?，減少葡萄糖的利用，因而使血糖及肝糖原增加，尿中可出現(xiàn)糖尿，同時增加胃液分泌，促進食欲。它主要用于治療各種炎癥、嚴(yán)重感染及傳染病、過敏性疾病、風(fēng)濕病、休克、代謝疾病以及引產(chǎn)。但長期使用DEX，可出現(xiàn)水腫、低血鉀、肌萎縮、骨質(zhì)疏松、脫鈣、病理性骨折、糖尿、幼畜生長停滯等［1］。因此，世界各國嚴(yán)格禁止DEX作為生長激素使用，同時普遍限制此藥物用于動物源性食品中，并提出了嚴(yán)格的限量要求［2－4］。我國及歐盟規(guī)定牛奶中DEX最高殘留限量(MRL)均為0.3 μg/kg;日本農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留物肯定列表制度中規(guī)定，DEX在牛奶中的 MRL為0.02 mg/kg。因此，為了保護人類健康，促進國際貿(mào)易發(fā)展，建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測牛奶和奶粉中DEX殘留量的分析方法非常必要。

目前，測定DEX的分析方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜法等［5，6］。本方法重點研究了牛奶和奶粉樣品的前處理和檢測條件，建立了用乙腈提取牛奶和奶粉中的DEX殘留，C18固相萃取柱凈化，配有大氣壓化學(xué)電離源的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定的檢測方法。該方法靈敏度高，選擇性好，能夠同時定性和定量。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

實驗用牛奶和奶粉樣品均為市售產(chǎn)品。

2.1.2 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純;甲酸為優(yōu)級純;超純水;0.1%甲酸溶液：移取1 mL甲酸于裝有約800 mL水的1L容量瓶中，用水定容至刻度并混勻;DEX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAS：50－05－2)：純度大于等于99%;C18 固相萃取柱(500 mg，3 mL);0.22 μm 有機系微孔濾膜。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

DEX標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取100 mgDEX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。儲備液在2℃ －4℃保存，可用3個月;DEX標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量的DEX標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇配成1 μg/mL 和 0.1 μg/mL兩種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在2℃ －4℃保存，可用1周;DEX基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要吸取適量的DEX標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白樣品提取液稀釋成適當(dāng)濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用前配制。

2.1.4 儀器與設(shè)備

LC－MSD－Trap－VL離子阱質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)：配有大氣壓化學(xué)電離源(APCI);渦旋混勻器(美國 SCIENTIFIC INDUSTRIES INC，VORTEX －GENIE 2);固相萃取裝置(美國 SUPELCO，VISIPRERTM DL);真空泵(德國 ABM，ME2C)：真空度應(yīng)達(dá)到80kPa;離心機(美國SIGMA，4K15);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國 Heidolph，LABOROTA 4000);氮氣吹干儀(北京八方世紀(jì)科技有限責(zé)任公司，BF－2000)。

2.2 方法

2.2.1 提取

2.2.1.1 牛奶樣品

稱取10 g試樣置于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，以5000 r/min離心10 min。取上清液至梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45℃水浴上減壓蒸發(fā)，將提取液濃縮至體積小于5 mL。

2.2.1.2 奶粉樣品

稱取2 g試樣置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL水，渦旋混勻30 s。以下操作同牛奶樣品。

2.2.2 凈化

將提取液移至經(jīng)3 mL乙腈和3 mL水預(yù)處理過的C18固相萃取柱中，用5 mL水洗滌梨形瓶和萃取柱，棄去全部流出液。在65 kPa的負(fù)壓下，減壓抽干1 min。用5 mL乙腈以≤3 mL/min流速洗脫，收集洗脫液于10 mL樣品管中，在45℃水浴中用氮氣吹干，用0.50 mL流動相溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.2.3 測定

2.2.3.1 液相色譜條件

(1)色譜柱：Inertsil ODS －3 C18，5μm，150 mm×2.1mm(內(nèi)徑);

(2)流動相：乙腈+0.1%甲酸溶液(50+50);

(3)流速：200 μL/min;

(4)柱溫：40 ℃;

(5)進樣量：20 μL;

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

(1)離子源：大氣壓化學(xué)電離源(APCI);

(2)掃描方式：正離子掃描;

(3) 定性離子對(m/z)：393.2/373.2;393.2/355.2;

(4)定量離子對(m/z)：393.2/373.2。

(5)其他質(zhì)譜參數(shù)：噴霧壓力：60 psi;干燥氣體流量：5 L/min;干燥氣體溫度：250℃;大氣壓化學(xué)電離源蒸發(fā)溫度：250℃;電暈電流：4000 nA;毛細(xì)管電壓：1500 V。

2.2.3.3 液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜測定

2.2.3.3.1 定性測定

比較樣品譜圖中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液譜圖中對應(yīng)的定性離子的相對豐度，偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。

表1 定性確證時相對離子豐度的最大允許誤差

2.2.3.3.2 定量測定

在上述色譜條件下，用6個不同濃度的DEX基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進樣，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中DEX的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取凈化條件的優(yōu)化

因為牛奶和奶粉樣品的主要雜質(zhì)為大量的蛋白，所以在選擇前處理操作條件時需重點關(guān)注如何去除蛋白的干擾。在參考文獻資料的基礎(chǔ)上，對Carrez試劑、不同體積的甲醇和乙腈的提取效率和去蛋白效果進行了對比。實驗結(jié)果顯示，對于10g牛奶和2g奶粉樣品，加入20mL乙腈渦旋提取后離心，去除蛋白效果良好且基本可將DEX提取完全。

為更好去除基質(zhì)的干擾并提高檢測方法的靈敏度，采用固相萃取凈化的方式實現(xiàn)對樣品提取液的凈化和濃縮。在本方法的研究中，對C18固相萃取柱(500mg，3mL)的使用效果進行了實驗。由于提取液中含有較多的乙腈，使提取液中的DEX殘留不能保留在C18固相萃取柱，因此，采用在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法除去提取液中的乙腈。實驗證明，該操作步驟能夠有效去除乙腈且不會造成DEX殘留的損失，并且經(jīng)過2.2.2后，能夠有效地實現(xiàn)對樣品提取液的凈化和濃縮。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

測定所用儀器為Agilent LC－MSD－Trap－VL離子阱型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。首先采用注射泵直接進樣方式，以300μL/h的流速將DEX標(biāo)準(zhǔn)溶液注入大氣壓化學(xué)電離源中，在正離子檢測方式下對DEX進行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)，得到DEX的分子離子峰。然后對DEX的分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息，獲得DEX的二級質(zhì)譜圖，見圖1。通過對分子離子碎裂振幅的參數(shù)進行優(yōu)化，使分子離子與特征碎片離子對強度達(dá)到最優(yōu)，再進一步優(yōu)化干燥氣體溫度、大氣壓化學(xué)電離源蒸發(fā)溫度、毛細(xì)管電壓、透鏡電壓等參數(shù)，使DEX的離子化效率達(dá)到最佳。

圖1 DEX的二級質(zhì)譜圖

3.3 液相色譜條件

通過實驗確定適當(dāng)?shù)囊合嗌V條件以取得較好的分離效果和較理想的峰形，采用該色譜條件進行檢測，DEX的保留時間約3.4 min。DEX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流圖見圖2。

圖2 DEX的選擇離子流圖(m/z 373.2;m/z 355.2)

3.4 線性范圍

根據(jù)DEX的靈敏度，分別用牛奶和奶粉樣品空白溶液配成 2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、20.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL 一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定，進樣量20μL，外標(biāo)法定量，峰面積對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中DEX的濃度作圖，其線性范圍、線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見表2。

3.5 方法的回收率和精密度

用不含DEX的牛奶和奶粉樣品進行添加回收率和精密度實驗。樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)DEX后，搖勻，使樣品充分吸收，然后按本方法進行提取和凈化，配備大氣壓化學(xué)電離源的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，其回收率和精密度見表3，牛奶和奶粉空白樣品以及低限加標(biāo)樣品的選擇離子流圖見圖3－6。從表中回收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法回收率范圍在65.0% －110.0%之間，4個水平相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在12.8%以內(nèi)。

表2 DEX線性方程和相關(guān)系數(shù)

表3 DEX添加回收率(%)和精密度

(續(xù)表)

圖3 牛奶空白樣品的選擇離子流圖(m/z 373.2)

圖4 牛奶加標(biāo)樣品(0.2 μg/kg)的選擇離子流圖(m/z 373.2)

圖5 奶粉空白樣品的選擇離子流圖(m/z 373.2)

圖6 奶粉加標(biāo)樣品(0.2 μg/kg)的選擇離子流圖(m/z 373.2)

4 小結(jié)

建立的測定牛奶和奶粉中DEX殘留量的液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜方法，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度符合規(guī)范要求，能夠滿足目前國內(nèi)外檢測標(biāo)準(zhǔn)的需要。本方法采用配有大氣壓化學(xué)離子源的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀作為檢測手段，是基于文獻調(diào)研的情況以及本實驗室的實際條件。由于該儀器為離子肼型質(zhì)譜儀，受其原理限制，檢測結(jié)果靈敏度和重現(xiàn)性較目前更新型的三重四極桿型液相色譜質(zhì)譜儀有一定差距。因此，如能利用三重四極桿型液相色譜質(zhì)譜儀進行檢測，本方法仍有較大的提升空間。

［1］閻繼業(yè).畜禽藥物手冊［M］.北京：金盾出版社，2007.

［2］EEC Council Directive［Z］No.96/22.

［3］EEC Council Regulation［Z］No.2593/1999.

［4］林維宣.各國食品中農(nóng)藥獸藥殘留限量規(guī)定［M］.大連：大連海事大學(xué)出版社，2003.

［5］DXM －SP07 Determination of Dexamethasone in bovine Muscle［S］.

［6］GB/T20741－2006畜禽肉中地塞米松殘留量的測定液相色譜：串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.