鄭新寶,劉 宏,陳靜波,蔣曉新,丁 鳳,孫杰敏,于 明

(1.新疆畜牧科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆哈密奧科畜牧生物科技有限責(zé)任公司，新疆 哈密 839000)

性別控制技術(shù)是通過人為干預(yù)使動物按人們所需的性別繁衍后代的技術(shù)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有選擇地繁殖理想性別的后代將大大提高畜群繁育的數(shù)量和生產(chǎn)性能改良的速度，從而可以節(jié)省大量的時間、精力和費(fèi)用[1]。

流式細(xì)胞分類儀(Flow cytometer)利用動物X和Y精子DNA含量存在的差異，實現(xiàn)對X和Y精子的分離。自Johnson等(1989年)首先報道利用流式細(xì)胞分類儀成功分離出兔的X和Y精子，并用分離精子授精產(chǎn)下后代以來，該技術(shù)的研究取得實質(zhì)性進(jìn)展，已成為目前分離動物精子最可靠的方法[2]。用分離的X精子體外受精、體外培養(yǎng)、玻璃化冷凍等技術(shù)結(jié)合生產(chǎn)的性控胚胎已經(jīng)進(jìn)入市場。筆者在新疆哈密進(jìn)行了較大規(guī)模的體外性控胚胎移植嘗試，取得了較為理想的效果。

1 材料和方法

1.1 受體母牛

選擇健康無病，發(fā)育良好，中等膘情，且有正常發(fā)情周期的南陽牛和新疆本地土雜種牛2 400頭作為受體母牛。

1.2 體外性控胚胎

購入常規(guī)冷凍和玻璃化冷凍兩種性控胚胎。

1.3 藥液

解凍液、移植液、血清等；PG(氯前列醇鈉)，0.2mg(2ml)/支（上海計劃生育研究所生產(chǎn)），靜松靈、利多卡因。

1.4 器械

體視顯微鏡、移植器、四孔培養(yǎng)器、培養(yǎng)箱。

1.5 受體牛的同期處理

用PG處理，直檢一側(cè)卵巢有功能性黃體的空懷牛，肌注劑量為0.4～0.6mg/頭·次。對同期處理發(fā)情牛群和自然發(fā)情牛群，每群每天至少早晚各觀察1次發(fā)情，每次至少15min以上，以接受爬跨為發(fā)情標(biāo)志[3]。

1.6 常規(guī)和玻璃化冷凍體外性控胚胎的解凍

1.6.1 胚胎解凍液的準(zhǔn)備 吸取3mL移植液，再吸取0.3mL血清，置于一次性培養(yǎng)皿中；取4孔板，吸取適量常規(guī)冷凍胚胎解凍液分別置于1號、2號、3號、4號孔；將培養(yǎng)皿、四孔板置于39℃恒溫板上備用。

1.6.2 胚胎解凍方法 常規(guī)冷凍體外性控胚胎解凍方法：從液氮罐中取出胚胎細(xì)管，在空氣中停留5 s，放入盛有35℃純凈水的解凍槽中，停留30 s取出。將細(xì)管兩端消毒后剪開，將胚胎依次移入1號、2號、3號、4號孔中，在39℃恒溫環(huán)境中各放置5min。將胚胎移入盛有移植液的培養(yǎng)皿中，鑒定級別，裝管移植。

玻璃化冷凍體外性控胚胎的解凍方法：用鑷子從液氮罐中取出細(xì)管，在裝有胚胎的液段還沒有離開液氮面時，用食指按住上端開口取出胚胎管，立刻將含液段的一端放入1號孔中，這時液體將自動流入1號孔中。核對1號孔中胚胎數(shù)并記錄。將胚胎依次移入2號、3號、4號孔中，在39℃恒溫環(huán)境中放置5min。將胚胎移入盛有移植液的培養(yǎng)皿中，鑒定級別，裝管移植。

1.6.3 胚胎鑒定 按照胚胎等級標(biāo)準(zhǔn)將解凍后的可用胚胎分為A、B、C 3個級別，胚胎分別裝管，標(biāo)記和記錄。

1.7 胚胎移植

以發(fā)情受體牛接受爬跨當(dāng)日計為第0天，在發(fā)情第7天，檢查受體牛。黃體側(cè)卵巢基部充實、有彈性，黃體直徑≥1.0 cm，可作為合格受體牛進(jìn)行移植。將胚胎細(xì)管裝入移植槍，套上移植外鞘、軟護(hù)膜，然后采用非手術(shù)法移入受體牛有黃體側(cè)子宮角大彎或更深部位[3]。

1.8 妊娠檢查與妊娠母牛管理

移植過的受體牛單獨(dú)組群集中飼養(yǎng)管理，在移植后50～70 d，用B超或直檢對受體牛進(jìn)行妊娠檢查。在移植90 d以后，再次對妊娠牛進(jìn)行復(fù)檢，以確定最終妊娠結(jié)果。

經(jīng)檢查確診妊娠的受體牛，分群單獨(dú)管理，供給充足的飼草飼料以保證滿足胎兒和母體的營養(yǎng)需求；注意采取措施防止妊娠牛之間互相頂架、擠撞、滑倒等以避免流產(chǎn)發(fā)生。

2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

建立數(shù)據(jù)庫，以移植后50～70 d的妊娠率為技術(shù)指標(biāo)，用生物統(tǒng)計學(xué)分析法，得出結(jié)果分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 體外性控胚胎冷凍方法對妊娠率的影響

使用常規(guī)冷凍法胚胎移植受體牛747頭次，妊娠218頭，受胎率為29.2%；使用玻璃化冷凍的體外性控胚胎，移植受體牛1 454頭次，妊娠510頭，受胎率為35.1%，受胎率有明顯提高(P＜0.01)。

表1 不同冷凍方法體外牛胚胎的妊娠結(jié)果對比

3.2 胚胎級別對妊娠率的影響

移植常規(guī)冷凍胚胎的受體牛為747頭次，其中移植A級體外性控胚胎260頭次，受胎率為35%；移植B級體外性控胚胎458頭次，受胎率為26.8%；移植C級體外性控胚胎29頭次，受胎4頭。A級體外性控胚胎的受胎率比B級的有明顯提高(P＜0.01)。

表2 常規(guī)冷凍法胚胎解凍后級別與妊娠結(jié)果的關(guān)系

移植玻璃化冷凍胚胎1 454頭次，其中移植A級的體外性控胚胎1 013頭次，受胎率37.4%；移植B級的體外性控胚胎390頭次，受胎率30.0%；移植C級的體外性控胚胎51頭次，受胎率27.5%。A級體外性控胚胎的受胎率比B級的有明顯提高(P＜0.01)。

表3 玻璃化冷凍法胚胎解凍后級別與妊娠結(jié)果的關(guān)系

玻璃化冷凍胚胎中A級胚胎的比率大，表明玻璃化冷凍方法對胚胎的損傷程度較小。同時其A級、B級、C級胚胎的受胎率均高于常規(guī)冷凍胚胎的受胎率，表明玻璃化冷凍胚胎的質(zhì)量要優(yōu)于常規(guī)冷凍胚胎。質(zhì)量較好的胚胎總是能獲得較高的受胎率。

3.3 不同黃體鑒定方法對妊娠率的影響

利用B超儀對受體牛的黃體進(jìn)行測定，并對測定結(jié)果中黃體直徑≥1.0 cm的129頭受體牛進(jìn)行了移植，妊娠36頭，受胎率為27.9%，相對于直腸檢查鑒定黃體，受胎率并無明顯變化。利用B超儀對受體牛的黃體進(jìn)行測定的優(yōu)點是比較直觀，可以在圖像上確定黃體的直徑大??；而直檢則比較方便、快捷，不僅可以大致判斷黃體直徑大小，而且可以根據(jù)手感判斷黃體的質(zhì)地和彈性，確定受體牛的黃體現(xiàn)狀。

表4 使用不同黃體鑒定方法對移植結(jié)果的影響

3.4 體外性控胚胎產(chǎn)母犢率的結(jié)果

在新疆哈密累計移植體外性控胚胎2 201頭次，妊娠728頭次。由于時間限制，對其中357頭出生犢牛的性別進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果顯示：有345頭犢牛為母犢，母犢率為96.6%，性別比例效果可靠。

3.5 體外性控胚胎妊娠后流產(chǎn)及出生死亡情況

在移植后50～70 d，用B超對受體牛進(jìn)行妊娠檢查，確定有728頭妊娠。在移植90 d以后，再次對妊娠牛進(jìn)行復(fù)檢，妊娠結(jié)果為625頭妊娠，有14.1%的妊娠消失。另外，在出生的犢牛中，有一些牛出現(xiàn)了難產(chǎn)現(xiàn)象和犢牛早期死亡，還有個別畸形牛出生，如無肛門、腹部皮膚未愈合、后軀多出一個后肢等。

4 小結(jié)

通過以上實驗及分析認(rèn)為，在規(guī)?；捏w外性控胚胎移植過程中，玻璃化冷凍胚胎取得了較為理想的受胎結(jié)果，胚胎質(zhì)量、性控比例也有很高的水平，為此項高科技產(chǎn)品的推廣打下了良好的基礎(chǔ)。同時，在妊娠牛的飼養(yǎng)管理、犢牛接生、犢牛護(hù)理及早期培育等眾多環(huán)節(jié)上，還有大量的工作要做。

[1] 盧克煥.分離精子及其在畜牧業(yè)中初步的應(yīng)用[C].中國奶業(yè)協(xié)會第19次繁殖技術(shù)研討會論文集.

[2] 余榮，楊利國.奶牛性別控制研究進(jìn)展[C].中國奶業(yè)協(xié)會第19次繁殖技術(shù)研討會論文集.

[3] 陳靜波.牛冷凍精液與胚胎移植技術(shù)問答.