梅光明 ，郭遠(yuǎn)明 ，陳雪昌 ，張小軍 ，朱敬萍 ，李鐵軍 ，龍 舉

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316100；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100）

組胺為一種生物胺，可在許多動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)，是生物體中的組氨酸在微生物脫羧酶的作用下脫羧而產(chǎn)生[1]，少量的組胺不僅是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫損傷的重要介質(zhì)之一，而且對(duì)應(yīng)答和炎癥反應(yīng)有著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。但過量的組胺通過通過與細(xì)胞膜上的兩類受體H1和H2作用而發(fā)生組胺中毒[3]。魚粉作為優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白飼料原料被廣泛使用于動(dòng)物生產(chǎn)中。實(shí)際上使用不新鮮、腐敗霉變的魚制作的魚粉很容易引起組胺含量過高，從而引起一系列組胺中毒事故[4-6]。我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水產(chǎn)品中的組胺限量有規(guī)定要求，但是還沒有制定魚粉組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前報(bào)道組胺的測(cè)定主要有分光光度法[7]、熒光檢測(cè)法[8]和液相色譜分析法[9-12]。由于魚肉基質(zhì)的復(fù)雜性，普通光譜法容易受雜質(zhì)干擾，定量不準(zhǔn)確，因而本文探討了利用高效液相色譜法來測(cè)定魚粉飼料中的組胺。

1 材料與方法

1.1 材料

所用飼料為市售常見魚粉飼料。

1.2 主要試劑

碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氨水（濃度25%～28%）為分析純，高氯酸為優(yōu)級(jí)純，甲醇、乙腈、丙酮和丹磺酰氯均為色譜純，鹽酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品（C5H9N3.2HCl，德國(guó) Dr.公司），純度＞99%。

0.4 mol/L 高氯酸溶液：取 24 mL 高氯酸（ρ=1.67 g/mL），用水稀釋至 1 000 mL；2 moL/L 氫氧化鈉：取4.0 g氫氧化鈉溶于50 mL水中；10 mg/mL丹磺酰氯溶液：稱取0.20 g丹磺酰氯，用20 mL丙酮溶解；鹽酸組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取8.3 mg的標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶中,用純水溶解并定容，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，折算成組胺濃度為1.00 mg/L，避光4℃冷藏保存，使用時(shí)用水稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Waters 600E高效液相色譜儀（配2489紫外檢測(cè)器），美國(guó)Waters公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；漩渦振蕩器，德國(guó)IKA公司；Centrifuge 5810臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，江蘇常州華普達(dá)儀器制造廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取

稱取1.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL的0.4 M高氯酸溶液，渦旋振蕩2 min，于6 000 r/min離心6 min，上層清液移入25 mL棕色容量瓶中。殘?jiān)儆?0 mL高氯酸溶液提取1次，離心后上清液合并于容量瓶中，最后用0.4 M高氯酸溶液定容至25.00 mL。取出1.0 mL移入5 mL容量瓶中，依次加入100 μL的2 moL/L氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL丹磺酰氯溶液，蓋緊蓋子，在水浴恒溫振蕩器中50℃下避光反應(yīng)50 min。反應(yīng)完畢后，加入100 μL濃氨水，靜置30 min，用已經(jīng)定容至5.0 mL，振蕩混勻，取適量的溶液過0.45 μm的有機(jī)相針式濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相及流速：水—乙腈（10+90，含 0.01 mol/L 乙酸銨）+0.01 mol/L 乙酸銨（75：25）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取組胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用純水稀釋成濃度分別為 2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 和 80.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液各1 mL，然后按照1.4.1的衍生化步驟反應(yīng)處理后供高效液相色譜分析。根據(jù)組胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，以峰面積為縱坐標(biāo)，以組胺濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 回收率和精密度

稱取1.00 g飼料樣品，分別向其中加入一定量的不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦混勻放置30 min，然后再進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)和凈化后進(jìn)行高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生劑的選擇

組胺分子中缺少發(fā)色基團(tuán)，本身無紫外吸收，因此為了提高檢測(cè)的靈敏度及其響應(yīng)，必須衍生化反應(yīng)才能經(jīng)紫外檢測(cè)。衍生方法有柱前衍生[13-14]和柱后衍生[15-16]，常見的衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）[13]、丹磺酰氯[17]、偶氮試劑[7]、苯甲酰氯[18]等。

鄰苯二甲醛（OPA）存在衍生試劑易失效、衍生物不穩(wěn)定等不足之處，有文獻(xiàn)報(bào)道組胺的OPA-亞硫酸鈉衍生物的穩(wěn)定性僅為20 min[19]，采用偶氮試劑比色法測(cè)定飼料中的組胺，易受魚粉中雜質(zhì)的干擾，苯甲酰氯也是測(cè)定組胺常用的衍生試劑之一，但苯甲酰氯不溶于水，與提取液分層，導(dǎo)致后續(xù)衍生化效果不佳，因此本實(shí)驗(yàn)采用了丙酮溶解的丹磺酰氯作為衍生試劑，能夠保證衍生化效率。組胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 組胺衍生化反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of histamine derivatization reaction

2.2 色譜圖

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，得到組胺標(biāo)準(zhǔn)品、空白及空白加標(biāo)樣品色譜圖如圖2～4所示。

由圖2～4結(jié)果可見，用本實(shí)驗(yàn)中的方法對(duì)魚粉樣品中的組胺進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)后經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，色譜圖峰型較好，信號(hào)響應(yīng)高，且無干擾雜峰，說明整個(gè)方法的提取和衍生化反應(yīng)效果好。

圖2 20.0 μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后色譜圖Fig.2 Chromatogram of histamine standard after derivatization

圖3 陰性魚粉樣品衍生化后色譜圖Fig.3 Chromatogram of negative fish meal sample after derivatization

圖4 陰性魚粉樣品300 mg/kg組胺加標(biāo)衍生化色譜圖Fig.4 Chromatogram of negative fish meal after derivatization spiked at 300 mg/kg histamine

2.3 線性范圍及檢測(cè)限

圖5為陰性魚粉樣品50 mg/kg組胺加標(biāo)衍生化反應(yīng)后的色譜圖，目標(biāo)峰信噪比大于10，方法回收率大于70%，由此可知50 mg/kg作為方法的定量檢出限可以滿足魚粉樣品中組胺的檢測(cè)需要。

配制組胺的工作曲線濃度系列為2.0～80.0 μg/mL，衍生化反應(yīng)后用配有紫外檢測(cè)器的液相色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組胺衍生物在2.0～80.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3，回歸方程為 Y=3.01×104x+2.56×104。

圖5 陰性魚粉樣品50 mg/kg組胺加標(biāo)衍生化色譜圖Fig.5 Chromatogram of negative fish meal after derivatization spiked at 50 mg/kg histamine

圖6 組胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.6 Standard curve of histamine after derivatization

2.4 方法回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證該方法檢測(cè)魚粉產(chǎn)品中組胺含量的適用性以及方法的準(zhǔn)確度和精密度，選取了市售2種魚粉產(chǎn)品為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，2種魚粉中添加組胺濃度為50～1 000 mg/kg范圍內(nèi)的3個(gè)加標(biāo)梯度下，回收率均大于70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，滿足分析檢測(cè)要求。

表1 魚粉樣品不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)Tab.1 Results of recovery and precision of spiked samples

3 結(jié)論

本文研究了利用柱前衍生和高效液相色譜儀測(cè)定魚粉產(chǎn)品中組胺的含量，建立了合適的樣品提取、衍生化反應(yīng)條件等前處理方法和最佳色譜分離條件。該方法簡(jiǎn)便快速，基體干擾小，線性范圍寬，回收率和檢出限令人滿意，可以適用于魚粉產(chǎn)品中組胺的檢測(cè)。