江繼平，馮 俊，唐嗣泉，劉世喜

(1.四川省公安廳，四川 成都 610041;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，四川 南充 637007;3.四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻喉咽－頭頸外科，四川 成都 610041)

喉癌是頭頸部原發(fā)于上皮的常見惡性腫瘤之一，目前主要治療還是以手術(shù)和放射治療為主，放療可以充分保護(hù)喉的發(fā)聲功能。ATM是與放射敏感性有關(guān)的基因，ATM蛋白表達(dá)水平差異與細(xì)胞放射敏感性程度之間存在一定的關(guān)系［1］。本研究中，我們使用反義多核苷酸作用于ATM以研究ATM蛋白表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)由四川大學(xué)華西醫(yī)院上呼吸道實(shí)驗(yàn)研究中心惠贈(zèng)。

1.2 試 劑

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit購(gòu)自美國(guó)Carlsbad公司;GAPDH單克隆抗體、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 試劑盒購(gòu)自Takara公司;ATM單克隆抗體、BCIP/NBT購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 目標(biāo)序列的選擇及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，設(shè)計(jì)反義ATM核苷酸(AS:5’-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3’);正義ATM 核苷酸(Sen:5’-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3’);錯(cuò)配 ATM 核苷酸 (Mis:5’-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3’)。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 多核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞

將生長(zhǎng)良好的Hep-2約2×105，置于6孔板中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到70－80%時(shí)備用。取0.8ug的反義ATM核苷酸、正義ATM核苷酸、錯(cuò)配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分別加入到Opti-MEM I中，在常溫下作用5分鐘。而后將核苷酸與Lipofectamine 2000在常溫下作用20分鐘后加入Hep-2細(xì)胞中，在37℃，5%CO2孵箱中作用。6小時(shí)后用PBS洗兩次。最后用 RPMI－1640取代 PBS，在37℃孵箱中過(guò)夜備用。

1.5 Western blot分析

收集1.4所述的細(xì)胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解緩沖液制備細(xì)胞總蛋白，總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜 )，用5%的脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜上的蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn)，加入ATM單克隆抗體(1:100)4℃過(guò)夜，GAPDH作為陽(yáng)性對(duì)照，加入二抗后BCIP/NBT試劑顯色、照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，變量資料之間的比較采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后，進(jìn)行Western blot分析，從圖1可以看出AS組蛋白表達(dá)明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質(zhì)體)組蛋白表達(dá)低，從圖2(各組蛋白表達(dá)的灰度掃描)可以更準(zhǔn)確的得出 AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對(duì)照組)的蛋白相對(duì)表達(dá)量以AS-lipo組最低，為48.14±5.53%，用SPSS 18.0軟件分析各組蛋白表達(dá)灰度可以得出，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

喉癌是頭頸部原發(fā)于上皮的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐漸上升。雖然其診斷和治療手段在過(guò)去的30多年已有飛速發(fā)展，但其5年生存率卻沒有顯著提高，目前主要治療還是以手術(shù)和放射治療為主［2，3］。放療可以充分保護(hù)喉作為發(fā)聲器官的重要生理功能、減少手術(shù)范圍和創(chuàng)傷，有其特有的優(yōu)越性。然而由于喉鱗癌細(xì)胞對(duì)射線的抗拒能力，導(dǎo)致放射敏感性降低，影響了治療效果［4］。

許多因素決定著細(xì)胞對(duì)放射線的反應(yīng)，其中細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力及細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞放射敏感性的主要決定因素［5］。而ATM基因在DSB損傷修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著極其重要的作用，因此成為腫瘤放射增敏的一個(gè)重要靶基因［6］共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia－telangiectasia，AT)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，以進(jìn)行性中樞神經(jīng)元變性免疫缺陷和對(duì)放射線敏感為特點(diǎn)，由于AT患者這種特殊的遺傳性的輻射敏感性，使得其致病基因(ataxia－telangiectasia mutant，ATM)已成為放射生物學(xué)界研究輻射敏感性機(jī)制的重要對(duì)象之一。因此，我們用反義ATM作用于喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(Hep－2)后，對(duì)其ATM蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討 ATM蛋白表達(dá)水平與喉癌細(xì)胞株間放射敏感性差異的關(guān)系，以期為進(jìn)一步了解臨床喉癌放射生物學(xué)特征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從Western blot分析，將多核苷酸AS轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染Sen、Mis、lipo相比，其蛋白表達(dá)量最低，僅為對(duì)照組(hep-2組)的(48.14±5.53)%，故反義 ATM核苷酸(AS)能有效抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中ATM蛋白的表達(dá)。已有研究表明，ATM蛋白表達(dá)水平差異與細(xì)胞放射敏感性程度之間存在一定的關(guān)系［1］。Zou Jian等［7］用脂質(zhì)體將反義ATM導(dǎo)入頭頸鱗癌細(xì)胞系SCCVII中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后ATM蛋白表達(dá)量減少，與轉(zhuǎn)入無(wú)關(guān)序列相比，轉(zhuǎn)染反義ATM的SCCVII細(xì)胞在輻照后表現(xiàn)出內(nèi)在放射敏感性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中我們用反義ATM使喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中ATM蛋白的表達(dá)降低，故我們推測(cè)其亦有可能使喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而可能為喉癌的非手術(shù)治療，保留喉的發(fā)聲功能、提高喉癌病人的生存質(zhì)量成為可能。

［1］LEI L，MICHAEL S，RANDY JL.Cellular responses to ionizing radiation damage ［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，(49):1157－1162

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