郝建華，王躍軍，劉均忠，孫 謐

（中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶工程室，山東 青島 266071）

紅酵母不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素，而且還能產(chǎn)生胡蘿卜素、蝦青素等天然物質(zhì)[1]。這些豐富的蛋白質(zhì)、纖維素和色素類物質(zhì)在紅酵母生長代謝過程中都積累在細胞內(nèi)。紅酵母具有結(jié)構(gòu)復雜的細胞壁[2-4]，影響細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，其細胞壁對提高酵母利用率十分重要。目前已報道的破壁方法有物理破壁[5]、化學破壁[6]、生物破壁[7-11]等方法，這些破壁方法有各自的優(yōu)缺點。本研究以一株自行分離的海洋紅酵母為試驗材料，采用酸堿法、珠磨法和酶溶法對其進行破壁處理，探討其破壁效率，以期為將來高效利用海洋紅酵母提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

海洋活性酵母YS-185，894堿性蛋白酶（活力單位13萬U/g），中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶工程室保存。

1.2 主要儀器

離心機：LC-6M型（上海市離心機械研究所）；752型紫外光柵分光光度計（上海分析儀器總廠）；BIOPHOT型Nikon相差顯微鏡（日本尼康公司）；Motics SFC-18型生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；恒溫水浴鍋（北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠）；KDL型珠磨機（瑞士WAB公司）。

1.3 酵母細胞酸堿法破壁

酵母細胞懸濁液在pH值3時于55℃處理36 h，然后將pH值調(diào)至12，繼續(xù)處理24 h，離心收集不容沉淀物，水洗2～3遍，噴霧干燥得酵母細胞壁。其中離心速度和時間均為400 r/min，15min。

1.4 酵母細胞珠磨法破壁

將培養(yǎng)好的海洋酵母細胞離心收集，取100 mg濕酵母細胞（干重約為15 mg）用冷去離子水清洗3遍后，移于試管中使其懸浮于濃度為0.1 mol/L、pH值為8.0的0.5 mL磷酸緩沖液中，按1∶1質(zhì)量比的比例添加玻璃珠，然后在漩渦混合儀上振動，處理時間分別為1、2、3 h，并隔一段時間用冰浴進行降溫。處理后的酵母細胞用冷去離子水清洗3遍，噴霧干燥得酵母細胞壁。

1.5 酵母細胞酶溶法破壁

在55℃下，酵母自溶6 h后，按400 mg/100g酵母液的添加量添加894堿性蛋白酶，pH值調(diào)至10.0于37℃下繼續(xù)酶解9 h后，煮沸5 min滅酶活，離心，水洗2～3遍，噴霧干燥得酵母細胞壁。

1.6 酵母細胞破壁率的評價

酵母細胞破壁率按公式α＝N1/（N1+N2）×100%計算。其中：α為酵母細胞破壁率；N1為顯微鏡下非正常形態(tài)的細胞數(shù)；N2為顯微鏡下形態(tài)正常的細胞數(shù)。在測定的時候隨即選取10個視野，進行平均。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿法破壁效果

酸堿法破壁雖然試驗步驟簡單易操作，但效果不理想，且一個操作周期比較長，生產(chǎn)中不宜采用此法進行破壁。從圖1中可知，細胞經(jīng)酸堿處理后無明顯變化，基本保持原形態(tài)，破壁率在10%左右。

圖1 酸堿法處理后的海洋酵母細胞

2.2 珠磨法破壁效果

珠磨法破壁選擇處理時間分別為1、2、3 h，機械破壁比較劇烈，能將細胞壁破碎，可以得到大小不一的細胞壁碎片，珠磨3 h后的酵母細胞破碎率比較高，碎片較多，顯微鏡下觀察珠磨法破碎海洋酵母細胞效果如下。

由圖2可以看出，珠磨破碎細胞1 h后，細胞部分破碎，細胞壁被處理成碎片，但破壁率不高（圖2-A）。珠磨2 h的破壁效果明顯好于前者，顯微鏡下觀察到的完整的酵母細胞已經(jīng)減少，碎片增多（圖2-B）。珠磨3 h后顯微鏡下觀察到的酵母細胞的完整細胞基本觀察不到，碎片比前兩者更多，破碎程度比較劇烈，破壁率為85%（圖2-C）。

圖2 珠磨法處理后的海洋酵母細胞

2.3 酶溶法破壁效果

酶溶法對海洋活性酵母進行破壁，破壁效果較好。從圖3中可以看出，海洋酵母細胞已完全破壁，細胞已成空殼，但仍保持原形態(tài)，未被解離成碎片，破壁率為80%左右。

圖3 酶溶法破壁處理后的酵母細胞

3 討論

酸堿法、酶溶法、珠磨法對海洋酵母YS－185的破壁結(jié)果各異：經(jīng)酸堿法處理后的細胞破壁效果不佳，細胞基本保持原形態(tài)；酶溶法破壁率可達80%左右，破壁效果比較理想；珠磨法破碎程度較強，效果較好，所得碎片大小不一，但此種方法只適用于實驗室規(guī)模的細胞破碎，且后處理工作復雜，對于中試規(guī)模的批量生產(chǎn)采用此種方法不太合理，設(shè)備耗損太大，而且珠磨法所需設(shè)備尚不能國產(chǎn)，需要進口，較為昂貴。因此，從操作規(guī)模、生產(chǎn)設(shè)備的限制、生產(chǎn)成本以及后處理工作等因素綜合考慮，酶溶法對海洋酵母細胞進行破壁不僅效果理想，而且將來在大規(guī)模生產(chǎn)中也是可行的。

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