趙 磊, 王成濤, 籍保平

鹿茸是我國有史記載以來的名貴動物藥之一,與人參、冬蟲夏草并列為三大補品,在國內(nèi)外享有很高聲譽.鹿茸做為保健品,具有生精補髓、養(yǎng)血益陽、強筋健骨、延年益壽等功效.研究報道,鹿茸中主要含有蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸、磷脂、糖類、固醇類、激素樣物質(zhì)、核酸、多胺及各種無機物質(zhì)[1-2].

鹿茸水提取物是鹿茸最為廣泛的服用形式之一[3].研究報道,鹿茸水提取物有著較好的免疫調(diào)節(jié)作用.金光湖等[4]報道鹿茸水提取物可增強遲發(fā)性免疫反應,并可增加脾細胞中玫瑰花結(jié)細胞的數(shù)量,同時可顯著提高綿羊紅細胞的凝集素值和溶血素值,對細胞免疫功能和體液免疫功能有促進作用.然而,韓國學者[5-6]在研究鹿茸水提取物對Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎大鼠的作用時,發(fā)現(xiàn)鹿茸水提取物具有免疫抑制作用.Kim等[6]報道鹿茸水提取物體外可以抑制抗原刺激的T細胞活化,并在高濃度下能夠降低巨噬細胞的吞噬作用.可見,鹿茸對免疫系統(tǒng)可能具有雙向調(diào)節(jié)作用,從而使人體內(nèi)環(huán)境達到穩(wěn)定狀態(tài).我們前期研究發(fā)現(xiàn),鹿茸水提取物在模擬胃腸消化過程中,隨著蛋白質(zhì)逐漸酶解,其對小鼠脾細胞增殖的促進作用消失,對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖的抑制作用增強[7],但具體原因還有待進一步闡明.

本研究報道了鹿茸水提取物中非蛋白成分(AEVA-S)、粗蛋白酶解物及分離組分對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響,并進行了初步鑒定,旨在探討其免疫調(diào)節(jié)活性及功能成分,為進一步的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鹿茸凍干超微粉,東北大興安嶺區(qū)科技局;SPF級Balb/c小鼠(合格證號:SCXK-(軍)2007-004),6～8周齡,雄性,中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心;胃蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶、刀豆蛋白 A(ConA),美國 Sigma化學公司;RPMI-1640高糖培養(yǎng)基,美國Gibico公司;青鏈霉素混合液、紅細胞裂解液、CCK-8試劑盒、Hepes,碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;超濾管,德國Sartorius公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

LGJ-18型冷凍干燥機,軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠;XDOS-1B型倒置顯微鏡,重慶光電有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱,日本Sanyo公司;Multiskan MK3型自動酶標儀,美國Thermo公司;TGL-20M型高速臺式冷凍離心機,湘儀離心機廠;SHIMADZU LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸水提取物非蛋白成分及粗蛋白的制備

根據(jù)有機溶劑沉淀法[8],略做調(diào)整,將AEVA-S和粗蛋白進行分離.向鹿茸水提取物的水溶液中緩慢加入無水乙醇,使乙醇終體積分數(shù)達到75%,4℃靜置過夜.將懸浮液以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min,沉淀物用75%乙醇洗滌.上清液和沉淀物分別進行冷凍干燥,得到AEVA-S和粗蛋白,冷凍干燥物粉末于4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 鹿茸水提取物非蛋白成分分離組分的制備[9]

采用半制備RP-HPLC技術(shù)對AEVA-S進行分離,得到AEVA-S(Ⅰ～Ⅴ)的半制備HPLC圖譜,見圖1.色譜條件:色譜柱采用Kromasil C18(10×250 mm,5μm),流動相A為0.1%TFA水溶液,流動相B為0.1%TFA乙腈溶液,流速為3 mL/min,檢測波長為260 nm,洗脫梯度為0～5%A,0～30 min;5% ～50%A,30～40 min;50%A,40～50 min.

1.2.3 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物及其分離組分的制備

采用蛋白酶水解鹿茸水提取物粗蛋白6 h,制備不同的蛋白酶酶解物.鹿茸水提取物中粗蛋白以50 g/L的質(zhì)量濃度溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)反應溫度、pH值,加入一定量的蛋白酶進行水解.水解過程中通過不斷加入1 mol/L NaOH或HCl來保持pH值不變,并保持溫度恒定.胃蛋白酶、胰酶及堿性蛋白酶的反應條件見圖2.

圖1 鹿茸水提取物中非蛋白成分的半制備HPLC圖譜Fig.1 Semi-preparative HPLC chromatogram at 260 nm of AEVA-S.

圖2 鹿茸水提取物的不同粗蛋白酶解物的制備流程Fig.2 Flow chart for the preparation of AEVA crude protein hydrolysates

采用超濾法對酶解產(chǎn)物進行分離,稱取一定量鹿茸水提取物粗蛋白的不同酶解產(chǎn)物,選用截留分子量為10,5,3 kDa的超濾膜分別超濾,將超濾后不同分子量范圍的酶解產(chǎn)物分別收集并冷凍干燥.

1.2.4 小鼠脾細胞懸液的制備

將小鼠(Balb/c)拉頸處死,無菌分離完整脾臟,用PBS沖去浮血,剝除結(jié)締組織及脂肪成分.脾組織剪碎后置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網(wǎng)上,用注射器針芯研磨,PBS液洗滌,用吸管收集沖洗液至離心管,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,加入3 mL紅細胞裂解液,靜置2 min,加入10 mL PBS終止反應,1 200 r/min離心5 min,棄上清液.用PBS液洗兩次,不完全RPMI-1640洗一次,加適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10 mM Hepes)重懸細胞.調(diào)整濃度至2×106個細胞/mL,臺盼蘭染色測細胞存活率大于95%.

1.2.5 脾淋巴細胞增殖實驗

將脾細胞懸液按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中,再添加10μL ConA(終質(zhì)量濃度為5μg/mL)或不添加ConA,10μL樣品溶液,每個處理設6個復孔.同時做正常對照組和ConA對照組,正常對照組為100μL脾細胞懸液,ConA對照組是在100μL細胞懸液中添加10μL ConA(終質(zhì)量濃度為5μg/mL).然后將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.

1.2.6 細胞增殖程度的測定及計算分析

選用CCK-8試劑盒測定細胞增殖程度.結(jié)果用刺激指數(shù)(Simulation index,SI)表示,計算如下:

1.2.7 液質(zhì)聯(lián)用分析

HPLC條件:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流速0.8 mL/min,檢測波長260 nm,柱溫30℃;流動相A相:0.05%甲酸水溶液,B相:0.05%甲酸乙腈溶液.梯度洗脫條件:(1)AEVA-SⅢ:0～5%A,0～30 min;(2)AEVA-SⅣ:0～5%A,0～30 min;5%～50%A,30～40 min;50%A,40～48 min.

質(zhì)譜條件:microTOF-QⅡ四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀.電噴霧離子源(ESI)噴射電壓為4.5 kV;正離子模式;噴霧壓力為0.6 bar;干燥氣(N2)流速為7 L/min,溫度為180℃;離子掃描范圍為50～1 000 m/z.

1.3 統(tǒng)計分析

每個實驗重復6次,結(jié)果以均值±標準偏差(Mean±S.D.)表示,采用組間t檢驗,P＜0.05具有顯著性差異,P＜0.01具有極顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 鹿茸水提取物中非蛋白成分及其分離組分免疫調(diào)節(jié)功能的研究

本研究通過體外各分離組分對小鼠脾細胞增殖的影響來評價其免疫調(diào)節(jié)作用.各分離組分對小鼠脾細胞增殖的影響見圖3.結(jié)果表明,低、高濃度的AEVA-S單獨作用均可顯著促進小鼠脾細胞增殖,SI值分別為1.05±0.03和1.13±0.02,與空白對照組相比增長了5%(P＜0.05)和13%(P＜0.01).低、高劑量的AEVA-S(Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ)本身均對小鼠脾細胞增殖無影響.高劑量的AEVA-SⅢ本身對小鼠脾細胞增殖有明顯的抑制作用(P＜0.05),抑制率為4.5%.推測AEVA-S本身對小鼠脾細胞增殖的促進作用是其各分離組分協(xié)同作用的結(jié)果.

圖3 非蛋白分離組分對小鼠脾細胞增殖活性的影響Fig.3 Effects of separated fractions from AEVA-Son the proliferation of murine splenocytes

由圖3可知,低、高濃度的AEVA-S,SⅠ,SⅡ均對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖無影響.然而,低、高濃度的 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ可顯著抑制ConA誘導的小鼠脾細胞增殖,尤以高濃度時最為明顯.在高濃度時(200μg/mL),AEVA-SⅢ和AEVASⅣ對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖抑制率分別達到了58.4%和36.5%.高濃度的AEVA-SⅢ對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖的高抑制率與其本身具有脾細胞毒性有關.此外,AEVA-SV在低劑量時對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖無影響,而在高劑量時對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖有輕微的抑制作用.

ConA是T淋巴細胞的有絲分裂原,可促進T淋巴細胞活化,進而使細胞產(chǎn)生細胞因子合成、細胞因子受體表達、細胞分化及細胞增殖等變化.T淋巴細胞是一類胸腺依賴型淋巴細胞,是血液和再生循環(huán)中的主要淋巴細胞,它在接受抗原刺激后可以發(fā)生特異性免疫應答.T淋巴細胞介導的細胞免疫應答主要針對細胞內(nèi)微生物的感染,也參與Ⅳ型超敏反應、移植排斥反應和某些自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展.機體內(nèi)T淋巴細胞的數(shù)量越大,增殖活性越高,機體由T淋巴細胞介導的細胞免疫功能越強[10].

絕大多數(shù)研究表明,在加入樣品的同時加入ConA,樣品的免疫調(diào)節(jié)活性較大.本研究結(jié)果顯示,鹿茸水提取物非蛋白分離組分——AEVA-SⅢ或AEVA-SⅣ與ConA同時加入,淋巴細胞增殖受到強烈抑制.Barta等[11]報道將乳清蛋白制劑與絲裂原同時加入淋巴細胞培養(yǎng)基時,淋巴細胞增殖被抑制,而將絲裂原與淋巴細胞共同孵育一定時間后再加入乳清制劑,則其對淋巴細胞增殖的抑制作用變得不明顯.發(fā)生該現(xiàn)象的機理有待進一步探討,推測是由于樣品影響了小鼠淋巴細胞對ConA的敏感性或是由于樣品預先與小鼠脾細胞膜上的ConA受體相結(jié)合,影響了ConA與小鼠脾細胞間的作用,使信號轉(zhuǎn)導途徑中斷,甚至根本不能形成,從而抑制了細胞的活化和增殖.后續(xù)實驗可采取先加樣品再加ConA的順序,來驗證AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ對ConA誘導的小鼠脾細胞增殖的抑制作用.

2.2 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ成分的初步鑒定

AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ的 HPLC-ESI-HRMS分析見表1.結(jié)合已報道鹿茸中存在的成分[1]以及質(zhì)譜結(jié)果,初步鑒定AEVA-SⅢ中主要含有8種化合物,分別為:鳥嘌呤、胞苷、黃嘌呤、尿苷、3′-AMP、2′-AMP 、3′-GMP 和 2′-GMP;初步鑒定 AEVA-SⅣ中主要含有5種化合物,分別為:腺嘌呤、肌苷、鳥苷、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷.

表1 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ主要成分的正離子HRMS分析Tab.1 Positive ion HRMSanalysis of main compounds in AEVA-SⅢ and AEVA-SⅣ

2.3 不同酶解產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)功能的比較

分別選取100μg/mL和500μg/mL兩個質(zhì)量濃度,測定3種酶解產(chǎn)物對小鼠脾細胞增殖的影響,結(jié)果如圖4.在100μg/mL的質(zhì)量濃度下,3種酶解產(chǎn)物單獨均不能刺激小鼠脾細胞增殖.質(zhì)量濃度為500μg/mL時,堿性蛋白酶酶解物單獨均可刺激小鼠脾細胞增殖,并有顯著性差異(P＜0.05).在低濃度和高濃度的條件下,3種酶解產(chǎn)物均可以抑制ConA誘導的小鼠T淋巴細胞增殖,抑制程度有所不同,且存在一定的量效關系.在低濃度下,對ConA誘導的小鼠T淋巴細胞增殖的抑制程度相對于高濃度時較低.在3種酶解產(chǎn)物中,堿性蛋白酶酶解物對ConA誘導的小鼠T淋巴細胞增殖的抑制程度遠低于其他兩種酶解產(chǎn)物.

圖4 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物對小鼠脾細胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of AEVA crude protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes

同種蛋白不同酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性差別取決于水解用酶的種類[12].肽的氨基酸組成、數(shù)量和序列對免疫活性也有重要影響,較強的疏水作用可能促使免疫活性肽與細胞膜相互作用而增強其免疫活性[13]. 疏水性氨基酸有 Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Pro和Ala.疏水性氨基酸在酶和基質(zhì)、抗體和抗原間的相互作用等各種非共價鍵的分子結(jié)合方面,具有重要作用.堿性蛋白酶和中性蛋白酶可為制備出肽鏈末端具有疏水性氨基酸的小肽提供先決條件.

2.4 不同酶解產(chǎn)物分子量分布的比較

采用超濾法分析3種蛋白酶酶解產(chǎn)物中大于10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa及小于3 kDa肽段的分子量分布,見圖5.數(shù)據(jù)表明,3種蛋白酶酶解物中主要由5～10 kDa及3 kDa以下肽組成,分別占總組成的30%以上.各蛋白酶解物以模擬胃腸消化物中大分子肽段含量最高,10 kDa以上肽段占總量的23.07%;而堿性蛋白酶水解物中10 kDa以上肽段僅占總量的5.3%,小分子肽段(＜5 kDa)達到了總量的62.5%.改變酶的水解順序也可影響酶解物的分子量分布.與模擬胃腸消化物相比,胰酶-胃蛋白酶酶解物中的大分子肽段(＞5 kDa)含量減少,同時小分子肽段(＜5 kDa)含量增加.在相同的時間內(nèi)(6 h),堿性蛋白酶對鹿茸水提取物中粗蛋白水解程度最大.

圖5 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物相對分子量分布Fig.5 Molecular size distribution of AEVA crude protein hydrolysates

2.5 不同分子量范圍肽段免疫調(diào)節(jié)活性研究

不同分子量范圍肽段 1(MW ＞10 kDa)、2(MW:5～10 kDa)、3(MW:3～5 kDa)和4(MW ＜3 kDa)對小鼠脾細胞增殖活性的影響見圖6.研究結(jié)果表明,不同分子量范圍肽段1,2,3和4單獨對小鼠脾細胞增殖的影響不同.分子量＞10 kDa的肽段在高、低濃度下單獨均能刺激小鼠脾細胞增殖,呈現(xiàn)絲裂原作用;其他分子量范圍肽段(2,3和4,除B4外)單獨對小鼠脾細胞增殖均無影響.這與Mercier和Diane等的研究結(jié)果一致,Mercier等[13]和Diane等[14]在小鼠脾細胞的體外培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn),分子量大于10 kDa的乳清蛋白和分子量小于2 kDa的酶解肽類,均能夠明顯促進脾細胞的增殖,且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性.胰酶-胃蛋白酶聯(lián)合酶解物中B4(分子量＜3 kDa的肽段)單獨亦對小鼠脾細胞增殖有促進作用,這可能與肽的氨基酸組成有關.

不同酶解物中不同分子量肽段對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖的影響不同.圖6(a)顯示了模擬胃腸消化物中不同分子量肽段對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖的影響.A1(分子量＞10 kDa的肽段)在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖,并有顯著性差異.其他分子量肽段(A2,A3和A4)對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖無影響.

圖6(b)顯示了胰酶-胃蛋白酶聯(lián)合酶解物中不同分子量肽段對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖的影響.結(jié)果表明,B1和B4(分子量＞10 kDa和＜3 kDa的肽段)在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖,并有顯著性差異.B2和B3(分子量在5～10 kDa、3～5 kDa的肽段)對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖無影響.

圖6 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物中不同分子量肽段對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.6 Effect of peptide fractions with different MW from AEVA crude protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes

此外,堿性蛋白酶酶解物中不同分子量肽段對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖的影響見圖6(c).我們發(fā)現(xiàn),C1,C2,C3和C4在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖,并有顯著性差異.造成這種現(xiàn)象的原因有:1)肽段影響了小鼠脾淋巴細胞對ConA的敏感性;2)酶解產(chǎn)物預先與小鼠脾淋巴細胞膜上的ConA受體結(jié)合,影響了ConA與小鼠脾淋巴細胞間的作用,使信號轉(zhuǎn)導途徑中斷,從而抑制了細胞的活化和增殖.發(fā)生該種現(xiàn)象的機理有待進一步探討.

上述結(jié)果表明,肽段的分子量是影響小鼠脾細胞增殖的主要因素之一.此外,酶解選用酶的種類也是重要影響因素.不同蛋白酶的底物特異性不同,酶切位點各異,酶的選擇影響了蛋白酶解物中肽段的分子量大小及氨基酸組成,從而導致的酶解產(chǎn)物免疫活性的差異.總的來說,鹿茸蛋白酶解物中大分子量肽段(＞10 kDa)對小鼠脾細胞的免疫活性影響最大.在有或無有絲分裂原存在時,酶解產(chǎn)物對脾淋巴細胞的作用差異機制還有待探討.酶解過程中釋放出的生物活性肽的氨基酸組成和肽序還需進一步研究.

3 結(jié) 論

本研究主要針對鹿茸水提取物,將其分為大分子蛋白和小分子非蛋白成分進行研究.以提高蛋白質(zhì)功能活性為目的,采用多種蛋白酶對粗蛋白進行酶解.非蛋白成分和粗蛋白酶解物分別采用HPLC和超濾法進行分離,并研究各分離組分對小鼠脾細胞增殖作用的影響,初步評價其免疫調(diào)節(jié)活性.結(jié)果表明,鹿茸水提取物非蛋白成分對未經(jīng)絲裂原誘導的小鼠脾細胞增殖的促進作用優(yōu)于其分離組分,對ConA誘導的小鼠脾T淋巴細胞增殖無影響.Fr.Ⅲ和Ⅳ對ConA誘導的T淋巴細胞增殖有抑制作用,初步鑒定均為堿基和核苷酸的混合物.分子量大于10 kDa的肽段,單獨可刺激小鼠脾細胞增殖,且對ConA誘導的T淋巴細胞增殖有抑制作用.分子量小于10 kDa的肽段,單獨對小鼠脾細胞增殖無影響,對ConA誘導的T淋巴細胞增殖的抑制作用不同,但總體相對較弱.肽段分子量大小對蛋白質(zhì)酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性影響較大,但并沒有呈現(xiàn)直接的相關性.肽的氨基酸組成、序列及構(gòu)型等等也是影響其活性的重要因素.

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