王萬(wàn)能，王 鵬，王 東，婁國(guó)平，龔曉林，范新發(fā)，趙遠(yuǎn)雕，邱重晏

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶市江津酒廠(集團(tuán))有限公司，重慶 402284)

中國(guó)傳統(tǒng)白酒由于其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和產(chǎn)品風(fēng)格，在世界六大蒸餾酒中占有重要的地位。小曲清香白酒在我國(guó)歷史悠久，是具有傳統(tǒng)特色的一個(gè)主要酒種。重慶小曲清香白酒主要以高梁等糧谷為原料，根霉小曲為糖化發(fā)酵劑，采用整粒原料經(jīng)蒸煮、做箱培菌糖化、續(xù)糟固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成。它以其醇香清雅、糟香突出、回甜、余味凈爽等獨(dú)特風(fēng)格而深受飲者喜愛(ài)［2］。

20世紀(jì)80年代至今，白酒微生物的研究進(jìn)入了高潮，各酒廠、科研機(jī)構(gòu)和學(xué)校紛紛對(duì)白酒微生物進(jìn)行研究。窖池中的生態(tài)因素與窖池中的微生物相互聯(lián)系、相互作用、相互制約協(xié)調(diào)共同構(gòu)建成了窖池特定微生物生態(tài)系統(tǒng)［3］。同時(shí)，由于曲藥以及現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)環(huán)境的微生物因素，在連續(xù)投料生產(chǎn)每一批次的窖池酒醅中，周而復(fù)始地重復(fù)進(jìn)行著微生物的消長(zhǎng)和變化過(guò)程，因此在同一個(gè)生產(chǎn)地點(diǎn)和成熟的生產(chǎn)計(jì)數(shù)條件下，微生物的構(gòu)成基本趨于穩(wěn)定，在正常的發(fā)酵發(fā)酵狀態(tài)下微生物的動(dòng)態(tài)變化是趨于一致的［4］。

本研究對(duì)江津小曲清香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的微生物進(jìn)行分離、純化、計(jì)數(shù)和鑒定，一方面了解江津酒釀造的主要菌種及主要特性和作用，另一方面可以了解有害微生物的種類(lèi)、性能和作用。通過(guò)了解控制發(fā)酵工藝來(lái)促進(jìn)有益菌的作用、抑制有害菌的活動(dòng)，提高和穩(wěn)定酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，為發(fā)現(xiàn)白酒發(fā)酵過(guò)程微生物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律和窖池發(fā)酵機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)［5］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)窖池

重慶市江津酒廠生產(chǎn)窖池。

1.2 樣品采集

從制箱開(kāi)始取樣，取制箱一天樣品。發(fā)酵中分別按入窖1、2、3、4、5 d跟蹤取樣。取樣深度在50 cm處，兩邊與中間三點(diǎn)混合均勻。

1.3 微生物的分離計(jì)數(shù)

1.3.1 根霉、芽孢桿菌及其他細(xì)菌的分離計(jì)數(shù)

配制LB、PDA培養(yǎng)基，無(wú)菌操作取樣2 g于滅菌的小燒杯中，加入滅菌水50 mL，稀釋倍數(shù)為10－3、10－4、10－5?？捎脺缇?.5 mL 離心管充分?jǐn)嚢杌靹?。?.2 mL的不同稀釋梯度濃度的菌液，涂布于LB、PDA固體培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)2次，培養(yǎng)1 d，觀察不同的菌落，分類(lèi)計(jì)數(shù)。計(jì)算得:純菌落數(shù)(個(gè)/g)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×125。通過(guò)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》配合細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定芽孢桿菌及其他細(xì)菌。通過(guò)《真菌鑒定手冊(cè)》鑒定出根霉菌［6］。

1.3.2 酵母菌的分離計(jì)數(shù)

將2 g樣品置50 mL無(wú)菌水，充分?jǐn)嚢杌靹?，稀?0－3～10－5個(gè)濃度梯度。用槍頭吸取0.2 mL的3個(gè)梯度稀釋好的懸液分別涂布于YEPD培養(yǎng)基平板，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出均勻菌落后計(jì)數(shù)。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后觀察，照相記錄菌落顏色和形態(tài)。然后依據(jù)《常見(jiàn)與常用真菌》進(jìn)行觀察與檢索［7－8］。

1.3.3 乳酸菌的分離計(jì)數(shù)

MRS培養(yǎng)基冷卻至46℃左右，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸鈣粉末，備用。樣品稀釋:無(wú)菌操作取樣2 g于滅菌的小燒杯中，加入滅菌水50 mL，稀釋倍數(shù)為 10－3、10－4、10－5。分別吸取不同稀釋度的稀釋液2 mL置于制作好的MRS培養(yǎng)基內(nèi)，鋪勻。用溶化冷卻至46℃左右的MRS培養(yǎng)基倒平皿，迅速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混合均勻，冷卻成夾層平板［9］。培養(yǎng)和計(jì)數(shù):將平皿倒置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀察長(zhǎng)出的細(xì)小菌落，取有溶鈣圈的菌落計(jì)數(shù)［10］。涂片，革蘭氏染色，鏡檢，對(duì)革蘭氏染色呈陽(yáng)性的桿狀細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類(lèi)菌種群在發(fā)酵過(guò)程的變化

在菌落生長(zhǎng)到適宜對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)培養(yǎng)皿中的菌落計(jì)數(shù)，并記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。本研究只對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的主要菌落進(jìn)行了分離鑒定計(jì)數(shù)，主要是根霉、酵母、芽孢、乳酸菌及其他細(xì)菌［11］。各類(lèi)菌在發(fā)酵過(guò)程的變化如表1所示。

表1 各類(lèi)菌在發(fā)酵過(guò)程的變化104個(gè)/g(酒醅)

2.2 發(fā)酵過(guò)程中微生物變化的動(dòng)態(tài)曲線分析

白酒發(fā)酵過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌群主要有酵母菌、乳酸菌、根霉、芽孢桿菌等以及其他細(xì)菌。這些微生物相互作用、相互協(xié)調(diào)在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮主要作用。微生物菌群數(shù)量的多少、種類(lèi)對(duì)酒質(zhì)的好壞有著很大的影響，所以可以調(diào)節(jié)其中微生物的動(dòng)態(tài)變化使有害菌群與有益菌群達(dá)到平衡的狀態(tài)，使酒質(zhì)大大提升，同時(shí)提高糧食利用率［12］。多糧小曲清香白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物變化趨勢(shì)如圖1所示。

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的微生物進(jìn)行分類(lèi)鑒定、計(jì)數(shù)、繪制動(dòng)態(tài)分析曲線，可更清晰地觀察和分析。根霉作為優(yōu)勢(shì)菌，在入窖發(fā)酵1 d后，菌落數(shù)量達(dá)到400×104個(gè)/g，然后隨著環(huán)境的變化，其數(shù)量越來(lái)越少，到出窖時(shí)則減少到最少，只有2個(gè)/g。

圖1 多糧小曲清香白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物變化趨勢(shì)

酵母菌屬酵母，作為主要優(yōu)勢(shì)菌，一直增加到發(fā)酵2 d，隨后雖有減少，但是一直到發(fā)酵后期都能被檢測(cè)到，酵母在酒精生產(chǎn)起最主要作用，其菌落數(shù)量高達(dá)740×104個(gè)/g。

乳酸菌屬細(xì)菌在入池前沒(méi)有檢測(cè)到，而在發(fā)酵后期逐漸增多，發(fā)酵第4 d菌落數(shù)達(dá)到12.8×104個(gè)/g，發(fā)酵5 d則又降低。

芽孢在入池時(shí)最多，可能是空氣等環(huán)境中的芽孢的進(jìn)入。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道芽孢可能是產(chǎn)淀粉酶有關(guān)。隨后則逐漸減少，發(fā)酵后期依然可檢測(cè)到，菌落數(shù)量也高達(dá)5 000個(gè)/g。

其他細(xì)菌在發(fā)酵第2 d數(shù)量最多，隨后由于氧氣的減少、pH值以及酒精的出現(xiàn)等環(huán)境的變化，細(xì)菌銳減，但是發(fā)酵末期依然有細(xì)菌存在。

3 分析與討論

根霉細(xì)胞中含有一定的酒化酶系，能邊糖化邊發(fā)酵，可使小曲酒整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中自始至終邊糖化邊發(fā)酵，所以發(fā)酵作用較徹底，淀粉出酒率進(jìn)一步得到提高，這一特性是其他霉菌所沒(méi)有的。發(fā)酵1 d后就達(dá)到了最高值，隨后有所減少，但一直伴隨在發(fā)酵過(guò)程中［13－14］。

釀酒酵母主要生長(zhǎng)在含糖量較高的偏酸性環(huán)境中，是兼性厭氧微生物，在繁殖時(shí)需要供給大量空氣，具好氣性;在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，它就不需要空氣，具厭氣性［15－17］。在開(kāi)始時(shí)數(shù)量不多，隨著發(fā)酵時(shí)間增加發(fā)酵環(huán)境更適宜酵母菌的生長(zhǎng)，到第二天達(dá)到了最高值，隨后減少，但在發(fā)酵過(guò)程中在大部分時(shí)間里是最優(yōu)勢(shì)菌。

從數(shù)據(jù)上來(lái)看乳酸菌數(shù)量明顯低于其他菌種數(shù)量。

酒中的眾多的香味成分來(lái)源于細(xì)菌的代謝，細(xì)菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌等，乳酸菌能使發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生乳酸，乳酸通過(guò)酯化產(chǎn)生乳酸乙酯，乳酸乙酯使白酒有獨(dú)特的香味，因此白酒生產(chǎn)需要適量的乳酸菌。但是乳酸菌過(guò)量使用會(huì)使酒醅酸度過(guò)大，影響出酒率和酒質(zhì)。酒中含乳酸乙酯過(guò)多，會(huì)使酒氣帶悶香［18］。芽孢桿菌在初期數(shù)量最大，與車(chē)間生產(chǎn)環(huán)境有很大關(guān)系，隨后逐漸減少，芽孢桿菌與產(chǎn)淀粉酶有很大關(guān)系［19］。其他細(xì)菌沒(méi)有依依分類(lèi)鑒定，它們可能也與酒的香氣產(chǎn)生有很大關(guān)系，有待于確定，希望今后在這方面進(jìn)一步開(kāi)展一些研究工作。

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