蘭成忠，李本金，李 煒，趙 健，陳慶河，翁啟勇

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建福州 350013

柑橘黑斑病也稱為黑星病，是柑橘的重要病害之一。此病也是我國(guó)出口預(yù)警重要病害及歐盟高度關(guān)注的檢疫性病害，有該病癥狀的鮮果一旦被檢出，將被禁止入境。以往柑橘黑斑病在我國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)零星發(fā)生，然而近年來(lái)逐漸加重并取代柑橘潰瘍病，成為制約鮮果出口歐盟的重要病害(王衛(wèi)芳等，2008;胡佳等，2010)。福建省也有相關(guān)報(bào)道，以前只在柑橘上發(fā)生，近幾年在柚子果實(shí)上也發(fā)現(xiàn)了該病的危害。該病菌雖然不為害果肉，但會(huì)嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)和銷售價(jià)值(Wallingford，2005;林石明等，2010)。

國(guó)內(nèi)研究表明，引起柑橘黑斑病病原菌的有性階段為柑橘球座菌Guignardia citricarpaKiely，無(wú)性階段為柑橘莖點(diǎn)霉Phoma citricarpaMcAlpine(蒲占湑和黃茜斌，2009;陳國(guó)慶等，2010，張玉潔等，2010)。但 Wulandariet al.(2009)研究認(rèn)為，亞洲(包括泰國(guó)、印尼和中國(guó))柚類Citrus maxima上發(fā)生的柑橘黑斑病病原菌為新種(亞洲種)Phyllosticta citriasianasp.nov。林石明等(2010)研究表明，引起福建省漳州琯溪蜜柚黑斑病的病原菌也為該新種P.citriasianasp.nov。但有關(guān)福建閩侯福橘黑斑病病原菌的種類尚未見報(bào)道。為此，筆者通過傳統(tǒng)的病原形態(tài)學(xué)，結(jié)合rDNA-ITS序列的比對(duì)分析，對(duì)福建省福橘果實(shí)上的柑橘黑斑病病原菌進(jìn)行鑒定，以期為更好地開展柑橘黑斑病的早期診斷和防治工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

柑橘黑斑病病果(福橘)采集于福建省福州市閩侯縣荊溪鎮(zhèn)龍臺(tái)山柑橘園，采回的病果裝入保鮮袋并放于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 病原菌分離及單孢純化

取病健交界處的組織，經(jīng)75%乙醇表面消毒1 min，無(wú)菌水漂洗3次，待表面水分晾干后置PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d。鏡檢確定病原菌產(chǎn)生分生孢子器后，用滅菌載玻片將培養(yǎng)基平板上的分生孢子器刮至滅好菌的研磨器中，使用滅菌研磨棒將分生孢子器充分磨碎，然后加入適量的滅菌蒸餾水，將分生孢子濃度配制為約1×104個(gè)·mL－1。用移液槍吸取20 μL懸浮液于 PDA培養(yǎng)基平板中，再用滅菌涂布棒將其涂布均勻，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h。于超凈工作臺(tái)上，用顯微鏡觀察PDA培養(yǎng)基平板上分生孢子萌發(fā)狀況，用手術(shù)刀片將由單個(gè)分生孢子萌發(fā)形成的微小菌落連同周圍的培養(yǎng)基一同切下，移入另一個(gè)PDA培養(yǎng)基平板上。新的PDA培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落即為獲得病原菌的單孢純化菌株，經(jīng)單孢純化后的菌株保存于PDA斜面上，置于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性測(cè)定

采用針刺和無(wú)傷口接種法，分別以病原菌的菌絲塊和孢子懸浮液作為接種體，在柑橘果實(shí)(由青轉(zhuǎn)黃的福橘)上進(jìn)行致病性測(cè)定。選擇健康無(wú)病斑的柑橘果，用75%酒精表面消毒，待果實(shí)表面酒精自然晾干后用于接種。針刺接種法:用滅菌的針頭刺傷健康無(wú)病的柑橘果實(shí)表皮后，挑取0.5 cm×0.5 cm待測(cè)菌株的菌絲塊于柑橘果實(shí)的傷口處;同時(shí)，用移液槍吸取20 μL病原菌孢子懸浮液滴在另一個(gè)果實(shí)的傷口處。無(wú)傷口接種法:未對(duì)健康的柑橘果實(shí)表皮進(jìn)行創(chuàng)傷，其余操作與針刺接種法相同。接種所用的病原菌孢子懸浮液濃度約為1×106個(gè)·mL－1，設(shè)清水處理為對(duì)照，在28℃下，保濕48 h，每隔2 d觀察癥狀。將接種后發(fā)病的果實(shí)進(jìn)行再分離，觀察分離得到的病菌是否與原接種菌相同。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察

將病原菌移接于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃下黑暗培養(yǎng)7 d，記錄菌落形態(tài)和顏色。同時(shí)，在顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形狀、大小等。

1.5 病原菌rDNA-ITS擴(kuò)增與序列分析

1.5.1 病原菌基因組DNA的提取 將28℃黑暗條件培養(yǎng)7 d的待測(cè)菌株的菌絲用接種針挑取數(shù)小塊，接種于馬鈴薯液體搖瓶培養(yǎng)基［配制方法參照方中達(dá)(1979)］中，置于 28 ℃、120 r·min－1的搖床上振蕩培養(yǎng)8 d。將液體培養(yǎng)基中的菌絲體用滅菌紗布過濾，分裝在2.0 mL離心管中，并將管蓋打開，置冷凍抽干機(jī)中將菌絲體中的水分充分抽干后，研磨成粉末備用。采用CTAB法(蘭成忠等，2008)提取各供試菌株基因組DNA。

1.5.2 rDNA-ITS擴(kuò)增與序列測(cè)定 采用真菌ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGrGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴(kuò)增該病原菌的ITS和5.8S rDNA。50 μL PCR反應(yīng)體系包括模板DNA 溶液2 μL(約10 ng)、10×PCR buffer(帶 Mg2+)5.0 μL、2.5 mmol·L－1dNTP 4.0 μL、10.0 μmol·L－1ITS1 和 ITS4 引物各 0.8 μL、5 U·μL－1Taq酶 0.8 μL，加 ddH2O 至 50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以后，克隆和測(cè)序的具體方法參照蘭成忠等(2008)。

1.5.3 病原菌rDNA-ITS序列同源性比對(duì)分析 在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件對(duì)測(cè)序得到的rDNAITS核苷酸序列與GenBank中已知種屬的相似序列同源性進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黑斑病的癥狀

柑橘黑斑病通常發(fā)生在福橘果實(shí)的成熟始期，果色由青轉(zhuǎn)黃階段，病斑圓形黑褐色，周圍有一暈圈(未熟青果上暈圈呈黃色，成熟果上暈圈為綠色)。發(fā)病初期病斑通常呈紅色至棕色，近收獲期病果癥狀更為典型:病斑中部稍凹陷，呈淺褐色至灰白色，直徑一般為1～3 mm;邊緣深紅至褐色，通常在病斑中部可見很多細(xì)小黑色稍凸起的粒點(diǎn)，即病菌的分生孢子器;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，多個(gè)病斑可愈合成不規(guī)則形的褐色至黑色大斑。

2.2 病原菌的致病性

采用針刺和無(wú)傷口接種法將8個(gè)已純化的菌株接種于健康的福橘果實(shí)上，7～11 d后，接種菌絲塊和分生孢子懸浮液的果實(shí)均能發(fā)病。針刺接種的果實(shí)發(fā)病比無(wú)傷口接種早3～4 d;同等條件下，菌絲塊接種的果實(shí)發(fā)病比分生孢子懸浮液接種早2～3 d;病狀與田間觀察到的相同，對(duì)照果實(shí)不發(fā)病。將發(fā)病果實(shí)的病斑進(jìn)行分離，再次獲得與原分離菌一致的病原菌，根據(jù)柯赫法則(Koch，1884)，證明接種菌為柑橘黑斑病的病原菌。

2.3 病原菌的形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基平板上的病原菌菌落呈黑色、平鋪，邊緣微呈裂瓣?duì)?圖1A)，且生長(zhǎng)比較緩慢。病原菌在培養(yǎng)過程中，菌落可產(chǎn)生黃色色素。28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為5.3～6.0 cm;8 d后菌落變成黑色、硬塊狀子座，子座上密生分生孢子器，分生孢子器近球形、黑色炭質(zhì)(圖1B)。分生孢子單孢、無(wú)色，呈橢圓形或卵形，大小為(7～12)μm×(5～8)μm，因分生孢子外包裹透明的黏狀附屬物不易分散而呈膠質(zhì)流溢出(圖1C)。病原菌的培養(yǎng)性狀及分生孢子器、分生孢子的形態(tài)特征與王衛(wèi)芳等(2008)、張玉潔等(2010)所報(bào)道的相同;同時(shí)與歐洲與地中海植物保護(hù)組織(OEPP/EPPO)2009年公布的柑橘黑斑病菌(柑橘球座菌G.citricarpaKiely)診斷標(biāo)準(zhǔn)中所描述的一致。

圖1 柑橘黑斑病病原菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characters of the pathogen of citrus black spot disease

2.4 病原菌rDNA-ITS的序列擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

本研究從供試的病原菌中挑選出1株形態(tài)特征典型的菌株118，以該菌株的基因組DNA為模板，用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1個(gè)約600 bp的片段(圖2)?？寺〔y(cè)序了該菌的rDNA-ITS序列，該片段全長(zhǎng)實(shí)際為632 bp。

圖2 菌株118 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of strain 118

2.5 rDNA-ITS 序列同源性聚類分析

通過GenBank中的BLAST功能，將菌株118的rDNA-ITS序列(GenBank登錄號(hào):JF681132)與GenBank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的170個(gè)ITS序列菌株均為柑橘球座菌。菌株118的ITS序列與已知柑橘球座菌序列的同源性為99.8%(GenBank登錄號(hào):FJ538315、FJ538316、HQ008221、GU060465);與亞洲柑橘葉點(diǎn)霉P.citriasiana序列的同源性為96.1%(GenBank登錄號(hào):FJ538354～FJ538359);與球座菌屬中相近種葡萄球座菌G.bidwellii、七葉樹球座菌G.aesculi、番石榴黑星病菌G.psidii、山茶球座菌G.camelliae、芒果球座菌G.mangiferae、落葉松球座菌G.laricina、咖啡球座菌G.coffeana的 ITS序列同源性為82.5% ～ 87.2%(GenBank 登 錄 號(hào):EU673223、AB095504、 HQ328039、 GU595026、 HU807531、AB454293、DQ377878)。

序列比較分析顯示，菌株118 ITS序列與柑橘球座菌(GenBank登錄號(hào):FJ538316)僅存在1個(gè)堿基差異，而與亞洲柑橘葉點(diǎn)霉(GenBank登錄號(hào):FJ538354)存在第 69、79、84、100、131、174、189、191、193、236、247、257、277、555 等 14 個(gè)位點(diǎn)上的堿基差異。進(jìn)一步利用分子生物學(xué)軟件Clustalx 2.0，按最大相似法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，亞洲柑橘葉點(diǎn)霉同屬于一個(gè)分支中;菌株118與柑橘球座菌(GenBank登錄號(hào):FJ538316)的遺傳距離最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個(gè)分支上，與球座菌屬其他菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)(圖3)。因此，綜合病原菌的形態(tài)特征、致病性及ITS序列分析結(jié)果，最終確定引起福建省福橘果實(shí)黑斑病的病原菌為柑橘球座菌G.citricarpa。

圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株118和球座菌屬其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 118 and other species of Guignardia based on rDNA-ITS sequences

3 討論

植物病原菌的準(zhǔn)確診斷鑒定是植物檢疫及植物病害研究的前提條件，對(duì)有效開展植物病害的防治工作具有重要意義。傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法主要依據(jù)其形態(tài)特征，然而，許多病原菌典型的形態(tài)特征很難獲得。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，根據(jù)DNA水平的差異進(jìn)行真菌的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究受到越來(lái)越多研究者的重視。目前，利用PCR擴(kuò)增病原菌rDNA-ITS基因序列在病原真菌的鑒定中已得到廣泛的應(yīng)用(張志華和洪葵，2006)。

本研究將引起福建省福橘果實(shí)黑斑病的病原菌鑒定為子囊菌亞門座囊菌綱座囊菌科球座菌屬中的柑橘球座菌G.citricarpa。該結(jié)果與Wulandariet al.(2009)和林石明等(2010)的研究結(jié)果不一致。這是否與地域和品種差異有關(guān)，福建省福橘果實(shí)上是否存在柑橘黑斑病病原菌新種(亞洲種)P.citriasianasp.nov或柑橘球座菌G.citricarpa和柑橘黑斑病病原菌新種(亞洲種)P.citriasianasp.nov復(fù)合侵染的情況等，都有待進(jìn)一步研究。

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