龍 飛 王春梅 孫潔林 胡 鈞,2

1（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 上海 200240）

2（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800）

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)成像具有納米級高分辨率[1]，其將一個對微小力非常敏感的微懸臂一端固定，另一端為微小探針，探針與樣品表面的相互作用能引起懸臂偏折，記錄此信號即可得到樣品表面的信息。AFM擺脫了掃描隧道顯微鏡[2,3]對于樣品導(dǎo)電性的限制，能在真空、氣相、液相等多種環(huán)境下進行檢測，在材料學(xué)、電子學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[4–11]。

然而，若 AFM 成像過程中未嚴格控制環(huán)境條件，環(huán)境溫度波動會引起儀器尺寸變化而導(dǎo)致熱漂移[12]。例如，一個1 mm長的部件，膨脹系數(shù)若為10–5/oC，則 1oC 的波動將產(chǎn)生 10 nm的尺寸變化。對宏觀尺度而言，這種熱漂移通?？珊雎裕坏诩{米尺度上，這將嚴重地影響 AFM 掃描的準確性。AFM的柵格掃描模式獲得一幅圖像常需數(shù)分鐘，受熱漂移影響，圖像的樣品形貌會發(fā)生失真，產(chǎn)生測量誤差。

本研究受電鏡中圖像處理技術(shù)的啟發(fā)[13–17]，將圖像配準技術(shù)應(yīng)用于 AFM 成像時熱漂移計算，并通過對熱漂移變化規(guī)律的分析，提出針對 AFM 圖像的熱漂移校正方法。此法廣泛適用于室溫大氣環(huán)境中AFM圖像的校正，能有效提高AFM圖像測量的準確性。

1 實驗條件及樣品制備

本實驗使用 MultiMode型原子力顯微鏡(美國Veeco/DI公司)，控制器為NanoScope IIIa，掃描管為J型。探針為Mikromasch公司的NSC-11硅探針，標稱彈性系數(shù)48 N/m，半徑10nm。

實驗所用襯底為云母。將20nm膠體金顆粒(Sigma公司)用純水稀釋10–50倍，取5–10μL滴在Parafilm膜上。將云母片緩慢蓋在膠體金液滴上，靜置2–3min后揭下，用純水沖洗，用吸耳球吹干待用。

2 基于圖像配準的熱漂移補償方法

圖像配準是指對不同視角用不同種傳感器，或在不同時刻，獲得同一場景的兩幅或多幅圖像不斷迭和的過程，使同一坐標下的像素對應(yīng)統(tǒng)一場景點。配準過程通常以其中一幅圖像作為參考圖像，其余為測量圖像，將測量圖像與參考圖像進行匹配。其匹配過程為：在參考圖像中以匹配點P為中心確定一個m×n窗口，該窗口區(qū)域即為模板，在測量圖像中選擇足夠大的搜索區(qū)域(以保證對應(yīng)點在該區(qū)域)，將模板在搜索區(qū)域中移動時所覆蓋的區(qū)域與模板進行比較，尋找相似性最大的區(qū)域中心點即為對應(yīng)的點。

在諸多匹配相似性的度量中，歸一化互相關(guān)函數(shù)具有對噪聲不敏感、匹配位置準確等特點，成為圖像配準的主要方法[18,19]。用相關(guān)系數(shù)γ(u,v)表征測量圖像和參考圖像間的相似度：

式中，γ(u,v)為相似系數(shù)，如果γ(u,v)達到最大值，那么u和v可以分別認為是圖像在X和Y方向上的漂移量。將連續(xù)掃描的 AFM 圖像視作取自不同時間的同一場景的圖像，以第一幅圖像為參考，后續(xù)圖像為測量圖像，就可算出連續(xù)掃描的 AFM 圖像間的熱漂移。圖1為連續(xù)50幅AFM圖像的配準結(jié)果，掃描范圍2 μm×2 μm，掃描速度2 Hz，分辨率256×256，總掃描時間為106.7 min?？梢夾FM開始工作時，漂移非常明顯，漂移的變化也很快，并隨機性很強。儀器工作一段時間后，各種環(huán)境因素和儀器本身趨于一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，漂移的性質(zhì)便呈近似線性變化。測量結(jié)果與文獻[20,21]報道一致，說明這是熱漂移普遍存在的性質(zhì)，因此能夠建立線性模型對熱漂移進行補償。

圖1 連續(xù)50幅AFM圖像的熱漂移變化曲線Fig.1 Thermal drift of 50 successively scanned images.

3 熱漂移引起的AFM圖像失真及校正

由于掃描過程中的熱漂移，成像過程中目標物體不斷偏移，所得 AFM 圖像產(chǎn)生失真，無法反映目標物體的真實形貌。本文所指的圖像失真主要是二維平面(X、Y)內(nèi)的拉伸或壓縮，而目標物體的高度信息(Z方向)由于始終由反饋回路控制，其準確性取決于系統(tǒng)誤差。

設(shè)襯底上有一正方形的目標物體，慢掃描方向為從上至下掃描。若X方向熱漂移為X–，Y方向熱漂移為Y–，則該正方形物體的AFM圖像如圖2(a)所示。即真實形貌(虛線)將在Y方向被拉長，并逐漸向X–方向偏移(實線)。若熱漂移方向為X+和Y+，其AFM圖像見圖2(b)。即真實形貌(虛線)將在Y方向被壓縮，并逐漸向X+方向偏移(實線)。由此可見，掃描過程中的熱漂移會使基于圖像的二維測量產(chǎn)生較大的誤差。如果能夠根據(jù)掃描時的熱漂移信息，對 AFM 圖像進行熱漂移校正，則能減小測量的誤差，提高AFM測量的準確性。

圖2 熱漂移引起的AFM圖像失真，正方形(虛線)表示物體形貌，平行四邊形(實線)表示AFM在熱漂移影響下掃描得到的該物體的圖像Fig.2 Image distortion induced by thermal drift.The square (dash line) represents the real shape of an object;the parallelogram (solid line) is AFM image of the object affected by thermal drifts.

根據(jù)AFM熱漂移的性質(zhì)，連續(xù)掃描多幅AFM圖像，得到每個掃描時刻熱漂移的估計值。計算AFM圖像的每條掃描線的熱漂移，從而恢復(fù)目標物體的真實形貌。圖 3(a)為云母表面 1.2 μm×1.2 μm內(nèi)20 nm膠體金顆粒的掃描圖像，掃描速率2 Hz，分辨率 128×256。AFM 啟動 1 h后，連續(xù)掃描10幅圖像，按照熱漂移的線性模型計算得到X、Y方向熱漂移速度分別為0.11和0.29 nm/s。根據(jù)掃描速率，可知每行掃描線在X方向向右偏移0.055 nm，Y方向被壓縮0.145 nm。因此，相比于樣品真實形貌，掃描的圖像在X方向右偏移，而在Y方向被壓縮。由圖2(b)，應(yīng)當將AFM圖像向X–和Y–方向拉伸，從而恢復(fù)真實形貌。圖3(b)中虛線方框表示原圖像大小。校正量分別為–1.17%和3.13%。原圖像中膠體金顆粒的縱橫比為0.91，而校正后的顆粒縱橫比為0.95，更接近其真實形貌。

圖3 AFM圖像失真校正A. 原掃描圖像；B. 校正后的圖像Fig.3 Correction of AFM image.A. Original image; B. Corrected image

由于熱漂移始終存在，每條掃描線本身也會受到熱漂移的影響。例如X方向熱漂移會導(dǎo)致掃描線伸長或縮短，Y方向熱漂移會導(dǎo)致掃描線向上或向下傾斜。只是由于每條掃描線所經(jīng)歷時間短，熱漂移影響可予忽略。因此，本文提出的方法僅針對掃描線間的熱漂移進行校正。

4 結(jié)語

室溫大氣環(huán)境中的熱漂移會導(dǎo)致 AFM 掃描圖像的失真，從而增大基于圖像的測量結(jié)果的誤差。我們在圖像配準方法的基礎(chǔ)上，通過對 AFM 圖像熱漂移性質(zhì)的分析，提出了一種圖像校正方法。實驗結(jié)果表明，在室溫大氣環(huán)境中沒有嚴格環(huán)境控制的條件下，這種方法能夠有效恢復(fù) AFM 掃描圖像的真實形貌，避免熱漂移導(dǎo)致的圖像測量誤差，有助于提高圖像二維平面內(nèi)測量的準確性。

1 Binnig G, Quate C F. Atomic force microscopy[J]. Phys Rev Lett, 1986, 56: 930–933

2 Binnig G, Rohrer H, Gerber Ch,et al. Tunneling through a controllable vacuum gap[J]. Appl Phys Lett, 1982, 40:178–180

3 Binnig G, Rohrer H, Gerber Ch,et al. Surface studies by scanning tunneling microscopy[J]. Phys Rev Lett, 1982,49: 57–61

4 Chen Z H, Appenzeller J, Lin Y M,et al. An integrated logic circuit assembled on a single carbon nanotube[J].Science, 2006, 311: 1735

5 Lyshevski S E. Carbon-based Nanoelectronics: NanoICs with fullerenes[C]. 4thIEEE Conference on Nanotechnology, 2004: 382–385

6 Scott R C, Deborah C, Barbara K,et al. Aiming for the heart: targeted delivery of drugs to diseased cardiac tissue[J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2008, 5:459–470

7 Avi S, Reuma H, Keren T,et al. Ultrasound triggered release of cisplatin from liposomes in murine tumors[J].Journal of Controlled Release, 2009, 137: 63–68

8 Scott R C, Wang B, Ramakrishna N,et al. Targeted delivery of antibody conjugated liposomal drug carriers to rat myocardial infarction[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 96: 795–802

9 Cavalcanti A, Shirinzadeh B, Freitas R A,et al.Nanorobot architecture for medical target identification[J].Nanotechnology, 2008, 19: 015103(1-15)

10 Menciassi A, Sinibaldi E, Pensabene V,et al. From miniature to nano robots for diagnostic and therapeutic applications[C]. 2010 Annual International Conference on EMBC, 2010: 1954–1957

11 Cavalcanti A, Shirinzadeh B, Kretly L C. Medical nanorobotics for diabetes control[J]. Nanomedicine, 2008,4: 127–138

12 Mokaberi B, Requicha A A G. Drift compensation for automatic nanomanipulation with scanning probe microscopes[J]. IEEE Transaction on Automation Science and Engineering, 2006, 3: 199–207

13 Frank J, Verschoor A, Boublik M. Computer averaging of electron-micrographs of 40s ribosomal-subunits[J].Science, 1981, 24: 1353–1355

14 Auer M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine[J].Journal of Molecular Medicine, 2000, 78: 191–202

15 Scheuring S, Fotiadis D, Moller C,et al. Single proteins observed by atomic force microscopy[J]. Single Molecules, 2001, 2: 59–67

16 Muller D J, Anderson K. Biomolecular imaging using atomic force microscopy[J]. Trends in Biotechnology,2002, 20: S45–S49

17 Frank J, Alali L. Signal-to-noise ratio of electron micrographs obtained by cross-correlation[J]. Nature,1975, 256: 376–379

18 Penczek P, Radermacher M, Frank J. Three-dimensional reconstruction of single particles embedded in ice[J].Ultramicroscopy, 1992, 40: 33–53

19 Lewis J P. Fast template matching[J]. Vision Interface,1995, 95: 120–123

20 John S, van Noor T, Kee O,et al. High speed atomic force microscopy of biomolecules by image tracking[J].Biophysical Journal, 1999, 77: 2295–2303

21 Abe M, Sugimoto Y, Namikawa T,et al.Drift-compensated data acquisition performed at room temperature with frequency modulation atomic force microscopy[J]. Appl Phys Lett, 2007, 90: 203103(1–3)