張錦明 張曉軍 張寶石 劉 健 王 卉 孫志軍 田嘉禾

1（解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 北京 100853）

2（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 胸心外科 北京 100048）

正電子核素18F標(biāo)記的肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等是用途較廣的分子顯像劑，用于腫瘤診斷及療效評(píng)價(jià)[1,2]。18F標(biāo)記這些生物小分子需特殊的聯(lián)接劑，如 4-18F-氟苯甲醛、2-18F-氟丙酸、N-琥珀酰亞胺2-[18F]氟苯甲酸酯[3–5]，采用這些中間體標(biāo)記，生物分子反應(yīng)步聚多、時(shí)間長(zhǎng)、條件較為苛刻，易發(fā)生副反應(yīng)，限制了18F標(biāo)記的生物分子應(yīng)用。采用溫和反應(yīng)，保護(hù)生物分子活性，減少副反應(yīng)，快速、高效的標(biāo)記方法對(duì)18F標(biāo)記尤其重要。

Sharpless等[6]提出了“點(diǎn)擊化學(xué)”，其核心是炔與疊氮反應(yīng)形成雜原子鏈接單元(C-X-C)的新合成方法，具有條件溫和、反應(yīng)速度較快、立體選擇性高等特點(diǎn)；在亞銅催化下，末端炔與疊氮化合物在常溫下發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定化合物。2006年，Marik等[7]用“點(diǎn)擊化學(xué)”合成了小分子肽。此后，Hausner等[8]用“點(diǎn)擊化學(xué)”合成了許多適于 PET成像的化合物，并比較了不同鏈接劑標(biāo)記含20個(gè)氨基酸的肽(A20FMDV2)時(shí)的生物學(xué)分布，他們發(fā)現(xiàn)：用 2-18F-氟丙酸、N-琥珀酰亞胺 2-[18F]氟苯甲酸酯(18F-SFB)或 5-18F-戊炔標(biāo)記的相同的 A20FMDV2時(shí)，三種標(biāo)記物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)有所差異，其中腫瘤攝取點(diǎn)擊合成的肽更高、更特異。

我們對(duì)國產(chǎn)18F多功能合成器[9]的管線作了部分調(diào)整，以細(xì)胞凋亡Caspase3的肽類抑制劑為研究對(duì)象，前體中含Caspase3抑制劑的核心結(jié)構(gòu)DEVD和疊氮，通過 5-18F-戊炔與疊氮前體反應(yīng)，全自動(dòng)點(diǎn)擊合成18F-Pen-peptide，并經(jīng)凋亡細(xì)胞初步證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Sumitomo HM-20S加速器，日本住友；PET-MF-2V-IT-1型多功能合成模塊(配備 Alltech 626雙泵和 UVSI 200全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Grace Alltima C-18(10′250) HPLC 柱)，派特(北京)科技有限公司；BioScan-3000放射性薄層掃描儀和Bio-Scan Hot-Cell四路放射性探測(cè)儀，美國BioScan公司。HPLC系統(tǒng)配Waters 雙515泵、2487紫外檢測(cè)器、Bio-Scan FlowCount，美國Waters公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司；LC/MS/MS，API2000，美國ABI公司。

1.2 合成方法

合成分二步進(jìn)行：1) 以5-OTs-戊炔為前體，在乙腈溶液中與干燥的18F/K2.2.2反應(yīng)，生成 5-18F-戊炔，再與乙腈共蒸餾得純的 5-18F-戊炔; 2) 在Cu(I)/抗壞血酸鈉/TBTA體系中，在亞銅催化下、5-18F-戊炔與疊氮短肽在室溫下點(diǎn)擊反應(yīng)15 min，經(jīng)半制備HPLC柱梯度分離，收集主要產(chǎn)品，再經(jīng)固相萃取得到產(chǎn)品，合成線路見圖1。

圖1 18F-Pen-peptide合成線路圖Fig.1 Scheme of 18F-Pen-peptide synthesis.

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 PET-MF-2V-IT-1型多功能合成模塊的改造及準(zhǔn)備

原有的多功能模塊不適合自動(dòng)化點(diǎn)擊化學(xué)合成，需將第一反應(yīng)管RV1的排氣管V9閥排氣口接到V10閥上，以便將生成的氣態(tài)中間體通入到第二反應(yīng)管RV2；同時(shí)將RV2更換成細(xì)管，方便少量溶液在 RV2內(nèi)反應(yīng)；在 RV2的底部放置 Bio-Scan Hot-Cell放射性探頭，便于探測(cè)由RV1傳輸?shù)姆派湫?圖 2)。在 V0閥之間安裝 QMA，用以捕獲18F離子，在V22和V23之間安裝Sep-Pak C-18柱。在1號(hào)瓶中加入1 mL乙腈溶解的20 mg K2CO3/7.5 mg K2.2.2；2號(hào)瓶中加入2 mL無水乙腈；3號(hào)瓶中加入0.5 mL無水乙腈溶解的20 mg 6-OTs-戊炔；4–6號(hào)瓶不用；7號(hào)瓶加入4 mL 0.2%(V/V)甲酸水溶液；8號(hào)瓶加入0.3 mL 0.1 mol/L硫酸銅溶液；9號(hào)瓶入裝 0.3 mL 50%(V/V)乙醇與乙腈混合液溶解的 11 mg的TBTA；將20 mg的抗壞血酸鈉和4 mg的疊氮短肽前體置于第二反應(yīng)管內(nèi)；固相萃取瓶13號(hào)瓶?jī)?nèi)裝100 mL水；11號(hào)瓶裝20 ml水；12號(hào)瓶?jī)?nèi)裝1.5 mL的USP級(jí)無水乙醇；在V23產(chǎn)品出口處安裝無菌濾膜和收集瓶。

2.2 自動(dòng)化點(diǎn)擊合成18F-Pen-Peptide

由派特(北京)科技有限公司提供的LibEditor的流程庫編輯軟件編寫自動(dòng)化合成程序，控制每個(gè)開關(guān)及加熱的溫度和時(shí)間，由上位機(jī)控制自動(dòng)運(yùn)行。過程如下：

(1) 加速器生產(chǎn)的18F–通過管線到QMA柱上被捕獲，同時(shí)將氧-18水分離；

(2) 1號(hào)瓶的K2CO3/K2.2.2乙腈溶液將QMA上的18F–離子淋洗入第一反應(yīng)管，通氮?dú)獠?15°C加熱共沸除水至干；

(3) 2號(hào)瓶中的無水乙腈加入第一反應(yīng)管，重復(fù)共沸除水；

(4) 3號(hào)瓶中的前體加入干燥的第一反應(yīng)管，110°C加熱，密閉反應(yīng)3 min；

(5) 8號(hào)瓶?jī)?nèi)的硫酸銅溶液加到第二應(yīng)管，以溶解管內(nèi)疊氮前體和抗壞血酸鈉，將 9號(hào)瓶?jī)?nèi)的 0.3 mL乙醇與乙腈混合液溶解TBTA加到第二反應(yīng)管內(nèi)，通氣混勻至透明；

(6) 再次加熱第一反應(yīng)管到 110°C，并通入氮?dú)?，將V9、V10、V16和V14打開，第一反應(yīng)管內(nèi)生成的 5-18F-戊炔由氮?dú)廨d帶入第二反應(yīng)管，由Bio-Scan Hot-Cell放射性探測(cè)儀測(cè)量管內(nèi)放射性，待放射性達(dá)到平衡后，并閉模塊，在室溫下靜置15 min。

圖2 多功能模塊自動(dòng)化點(diǎn)擊合成18F-Pen-peptide示意圖Fig.2 Schematics of the automated click chemistry synthesis of 18F-Pen-peptide on PET-MF-2V-IT-1.

(7) 啟動(dòng) HPLC純化程序，將第二反應(yīng)管內(nèi)的產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到 10號(hào)中轉(zhuǎn)瓶，用 7號(hào)瓶?jī)?nèi) 4 mL 0.2%(V/V)甲酸水清洗反應(yīng)瓶，并轉(zhuǎn)移到10號(hào)瓶。打開G0將10號(hào)瓶?jī)?nèi)液體裝載到LOOP環(huán)中，啟動(dòng)純化；首先用 0.2%(V/V)甲酸作流動(dòng)相，流速為 6 mL/min，第 5、10、15、20 min后改為5%(V/V)、10%(V/V)、15%(V/V)、18%(V/V)乙腈含 0.2%(V/V)甲酸；流速不變，第30–35 min出現(xiàn)產(chǎn)品峰，打開V18，將產(chǎn)品收集到固相萃取瓶13號(hào)內(nèi)。

(8) 啟動(dòng)固相萃取程序，先將 HPLC收集液與100 mL水混勻，將混合液壓出，產(chǎn)品被Sep-Pak C-18小柱吸附，用11號(hào)瓶?jī)?nèi)水清洗C-18柱，最后用1.5 mL USP乙醇將產(chǎn)品從C-18柱上淋下進(jìn)入收集瓶，用生理鹽水稀釋。

2.3 化學(xué)純度和放射化學(xué)純度的測(cè)量

放射化學(xué)純度用 HPLC測(cè)量，流動(dòng)相為18%(V/V)乙腈含0.2%(V/V)甲酸，分析柱為：Grace Alltima C-18，5 μm，10 mm′250 mm，流速為 1 mL/min，紫外波長(zhǎng)210 nm，用LC/MS/MS分析產(chǎn)品的比活度和產(chǎn)品中K2.2.2的含量[10]。

2.4 A549肺腺癌細(xì)胞經(jīng)化療后凋亡及對(duì)18F-Pen-Peptide攝取

常規(guī)方法在多孔板培養(yǎng)A549肺腺癌細(xì)胞中，分成化療組和對(duì)照組，前者系在培養(yǎng)板上每孔內(nèi)加入卡鉑注射液100 μL(25 mg/mL)，混勻后置入溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后培養(yǎng)板每孔中加入18F-Pen-peptide 50 kBq/100 μL，置入溫箱中 60 min，測(cè)量A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)18F-Pen-peptide的攝取率。

用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V法定量檢測(cè)平行對(duì)照組和化療組細(xì)胞凋亡，應(yīng)用Annexin V-fluos試劑盒進(jìn)行 Annexin V-FITc(異硫氰酸熒光素)及碘化丙啶(PI)標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，計(jì)算凋亡率。

3 結(jié)果和討論

3.1 18F-Pen-Peptide的點(diǎn)擊合成

可用于18F標(biāo)記的炔類很多，Marik等[7]比較了三種氟標(biāo)記炔的沸點(diǎn)，其中 5-18F-氟戊炔的沸點(diǎn)為76°C，與乙腈相近，較易蒸出，本研究選用 5-18F-氟戊炔作鏈接劑。步驟如下：

第一步，在無水條件下經(jīng)K2.2.2催化，氟離子親核取代 6-OTs-戊炔上的甲苯磺?；?5-18F-氟戊炔。加熱并通入氮?dú)猓瑢?5-18F-氟戊炔從 RV1蒸發(fā)到RV2中。因合成5-18F-氟戊炔時(shí)放射性活度高，無法直接測(cè)量從氟-18離子轉(zhuǎn)化成5-18F-氟戊炔的效率，從 RV2外置的放射性探頭估算，蒸餾到RV2的5-18F-氟戊炔合成效率約為51%。

全自動(dòng)點(diǎn)擊合成的關(guān)鍵是自動(dòng)合成 5-18F-氟戊炔，普通多功能合成模塊可合成 5-18F-氟戊炔，但不能將之蒸出。因其管線插到反應(yīng)管底，以確保轉(zhuǎn)移全部液體。本模塊向反應(yīng)管通入氮?dú)夂拖蛲廨斔鸵后w為同一管線，將排氣管線通過V9接到V10上，通過V10的開閉，將RV1內(nèi)氣體排到空氣中或排到RV2，達(dá)到除乙腈或蒸發(fā)5-18F-氟戊炔的目的。

第二步，在亞銅催化下，5-18F-氟戊炔與疊氮短肽前體發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，如直接用亞銅就需氮?dú)獗Ｗo(hù)，以防亞銅的氧化。本研究采用抗壞血酸鈉還原硫酸銅的方法，將硫酸銅溶液和抗壞血酸鈉分開放置，在5-18F-氟戊炔蒸餾前2 min混和，再加入TBTA后通入5-18F-氟戊炔，標(biāo)記效率近99%(圖3)，只有在Rt=27 min處有一小雜質(zhì)峰。

圖3 半制備分離純化18F-Pen-peptide的放射性HPLC圖Fig.3 Semi-HPLC radio-chromatogram of purified18F-Pen-peptide.

經(jīng)HPLC分離后，采用本模塊配備的固相萃取程序，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)點(diǎn)擊合成。以74–92.5 GBq的氟-18離子為原料，經(jīng)HPLC純化和固相萃取，最終合成得到14.8–22.2 GBq的產(chǎn)品，其放射性活度足以滿足臨床 PET/CT顯像；合成效率為(21.0±4.5)%(n=6，未校正)；所用時(shí)間為70 min，主要消耗在點(diǎn)擊合成(15 min)和HPLC純化(35 min)，但該結(jié)果明顯優(yōu)于原來以18F-SFB合成18F-FB-RGD的結(jié)果[11](合成效率33.6%，不作校正為16.8%，耗時(shí)110 min)。

文獻(xiàn)[12]采用一鍋法點(diǎn)擊合成了幾個(gè)小分子化合物，即生成的18F-炔不從反應(yīng)管內(nèi)蒸出，直接在同一反應(yīng)管內(nèi)加入硫酸銅溶液、抗壞血酸鈉、TBTA疊氮前體，最終合成效率在10%–30%。如果能采用一鍋法點(diǎn)擊合成生物分子，則采用普通的F-18多功能合成模塊均可合成，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道類似工作，本研究也未作該方面的嘗試。

3.2 18F-Pen-Peptide的質(zhì)量控制

圖4的HPLC分析表明，18F-Pen-peptide的放化純度大于 99%，同時(shí)共進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)品(19F-Penpeptide)的UV保留時(shí)間表明，放射性峰與標(biāo)準(zhǔn)品在HPLC上的保留時(shí)間相同，證實(shí)放射性物質(zhì)為18F-Pen-peptide。其 LC/MS/MS測(cè)量發(fā)現(xiàn)放射性峰處有一1153.6質(zhì)量峰，同時(shí)有一強(qiáng)的1175.6質(zhì)量峰；1153.6是19F-Pen-peptide的m/e的質(zhì)量峰，而1175.6則為絡(luò)合了一個(gè)鈉離子的峰。

圖4 純化后的18F-Pen-peptide與標(biāo)準(zhǔn)品混進(jìn)樣的HPLC放射性和UV譜Fig.4 UV & radio-chromatogram HPLC of 18F-Pen-peptide with standards.

采用 LC/MS/MS測(cè)量標(biāo)記物中的19F-Penpeptide的含量，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，測(cè)得產(chǎn)品的比活度為 870 GBq/μmol。

采用LC/MS/MS測(cè)量產(chǎn)品中K2.2.2含量，低于LC/MS/MS的測(cè)量靈敏度(10 ng/mL)，原因是采用蒸發(fā)法制備 5-18F-氟戊炔，在 RV2中幾乎不含K2.2.2，再經(jīng)HPLC純化，則K.2.2.2含量很低。

3.3 A549肺腺癌細(xì)胞經(jīng)化療后凋亡及對(duì)18F-Pen-peptide攝取

正常A549肺癌細(xì)胞與18F-Pen-peptide混合60 min后基本不攝取放射性，攝取率為(0.06±0.01)%，此時(shí)細(xì)胞凋亡率為(1.02±0.31)%；而經(jīng)卡鉑化療的腫瘤細(xì)胞對(duì)放射性的攝取值為(0.86±0.04)%，細(xì)胞凋亡率為(10.23±2.43)%。可見化療后腫瘤細(xì)胞凋亡增加，對(duì)18F-Pen-peptide放射性攝取也增加。

18F-Pen-peptide是含有DEVD核心的小分子肽，含DEVD的肽為細(xì)胞凋亡Caspase3的抑制劑，因此18F-Pen-peptide能與高表達(dá)Casepase3的凋亡細(xì)胞結(jié)合，放射性攝取值間接表達(dá)了細(xì)胞Caspase3的活性，從而表達(dá)了細(xì)胞凋亡的程度，18F-Pen-peptide與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及動(dòng)物 MicroPET顯像將在其他文章中進(jìn)一步報(bào)告。

4 結(jié)語

在修改后的 PET-MF-2V-IT-1型雙管多功能合成模塊上，以 5-OTs-戊炔為前體親核反應(yīng)制備了5-18F-氟戊炔，加熱將之蒸餾到 RV2中，在亞銅催化下與疊氮前體發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)生成18F-Pen-peptide，最后經(jīng)HPLC純化和固相萃取得到放化純度高、比活度較高的凋亡顯像劑18F-Pen-peptide，總合成效率為(21.0±4.5)% (n=6，未校正)，最終產(chǎn)品的放化純度為99%，比活度為870 GBq/μmol，合成時(shí)間為70 min。經(jīng)A549細(xì)胞攝取表明，未化療的腫瘤細(xì)胞基本不攝取放射性，卡鉑化療24 h后腫瘤細(xì)胞明顯攝取放射性，凋亡增加，放射性攝取也增加。18F-Pen-peptide是有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的正電子肽類細(xì)胞凋亡顯像劑。

致謝感謝西門子公司分子影像部的張健教授為本研究提供了關(guān)鍵試劑。感謝北京派特科技有限公司的胡曉平工程師為模塊的修改提供了技術(shù)支持。

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