張錦明 張曉軍 張寶石 劉 健 王 卉 孫志軍 田嘉禾
1(解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學科 北京 100853)
2(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 胸心外科 北京 100048)
正電子核素18F標記的肽、蛋白質、寡核苷酸等是用途較廣的分子顯像劑,用于腫瘤診斷及療效評價[1,2]。18F標記這些生物小分子需特殊的聯(lián)接劑,如 4-18F-氟苯甲醛、2-18F-氟丙酸、N-琥珀酰亞胺2-[18F]氟苯甲酸酯[3–5],采用這些中間體標記,生物分子反應步聚多、時間長、條件較為苛刻,易發(fā)生副反應,限制了18F標記的生物分子應用。采用溫和反應,保護生物分子活性,減少副反應,快速、高效的標記方法對18F標記尤其重要。
Sharpless等[6]提出了“點擊化學”,其核心是炔與疊氮反應形成雜原子鏈接單元(C-X-C)的新合成方法,具有條件溫和、反應速度較快、立體選擇性高等特點;在亞銅催化下,末端炔與疊氮化合物在常溫下發(fā)生反應,生成穩(wěn)定化合物。2006年,Marik等[7]用“點擊化學”合成了小分子肽。此后,Hausner等[8]用“點擊化學”合成了許多適于 PET成像的化合物,并比較了不同鏈接劑標記含20個氨基酸的肽(A20FMDV2)時的生物學分布,他們發(fā)現(xiàn):用 2-18F-氟丙酸、N-琥珀酰亞胺 2-[18F]氟苯甲酸酯(18F-SFB)或 5-18F-戊炔標記的相同的 A20FMDV2時,三種標記物體內(nèi)動力學有所差異,其中腫瘤攝取點擊合成的肽更高、更特異。
我們對國產(chǎn)18F多功能合成器[9]的管線作了部分調整,以細胞凋亡Caspase3的肽類抑制劑為研究對象,前體中含Caspase3抑制劑的核心結構DEVD和疊氮,通過 5-18F-戊炔與疊氮前體反應,全自動點擊合成18F-Pen-peptide,并經(jīng)凋亡細胞初步證實。
Sumitomo HM-20S加速器,日本住友;PET-MF-2V-IT-1型多功能合成模塊(配備 Alltech 626雙泵和 UVSI 200全波長紫外檢測器,Grace Alltima C-18(10′250) HPLC 柱),派特(北京)科技有限公司;BioScan-3000放射性薄層掃描儀和Bio-Scan Hot-Cell四路放射性探測儀,美國BioScan公司。HPLC系統(tǒng)配Waters 雙515泵、2487紫外檢測器、Bio-Scan FlowCount,美國Waters公司;流式細胞儀,美國BD公司;LC/MS/MS,API2000,美國ABI公司。
合成分二步進行:1) 以5-OTs-戊炔為前體,在乙腈溶液中與干燥的18F/K2.2.2反應,生成 5-18F-戊炔,再與乙腈共蒸餾得純的 5-18F-戊炔; 2) 在Cu(I)/抗壞血酸鈉/TBTA體系中,在亞銅催化下、5-18F-戊炔與疊氮短肽在室溫下點擊反應15 min,經(jīng)半制備HPLC柱梯度分離,收集主要產(chǎn)品,再經(jīng)固相萃取得到產(chǎn)品,合成線路見圖1。
圖1 18F-Pen-peptide合成線路圖Fig.1 Scheme of 18F-Pen-peptide synthesis.
原有的多功能模塊不適合自動化點擊化學合成,需將第一反應管RV1的排氣管V9閥排氣口接到V10閥上,以便將生成的氣態(tài)中間體通入到第二反應管RV2;同時將RV2更換成細管,方便少量溶液在 RV2內(nèi)反應;在 RV2的底部放置 Bio-Scan Hot-Cell放射性探頭,便于探測由RV1傳輸?shù)姆派湫?圖 2)。在 V0閥之間安裝 QMA,用以捕獲18F離子,在V22和V23之間安裝Sep-Pak C-18柱。在1號瓶中加入1 mL乙腈溶解的20 mg K2CO3/7.5 mg K2.2.2;2號瓶中加入2 mL無水乙腈;3號瓶中加入0.5 mL無水乙腈溶解的20 mg 6-OTs-戊炔;4–6號瓶不用;7號瓶加入4 mL 0.2%(V/V)甲酸水溶液;8號瓶加入0.3 mL 0.1 mol/L硫酸銅溶液;9號瓶入裝 0.3 mL 50%(V/V)乙醇與乙腈混合液溶解的 11 mg的TBTA;將20 mg的抗壞血酸鈉和4 mg的疊氮短肽前體置于第二反應管內(nèi);固相萃取瓶13號瓶內(nèi)裝100 mL水;11號瓶裝20 ml水;12號瓶內(nèi)裝1.5 mL的USP級無水乙醇;在V23產(chǎn)品出口處安裝無菌濾膜和收集瓶。
由派特(北京)科技有限公司提供的LibEditor的流程庫編輯軟件編寫自動化合成程序,控制每個開關及加熱的溫度和時間,由上位機控制自動運行。過程如下:
(1) 加速器生產(chǎn)的18F–通過管線到QMA柱上被捕獲,同時將氧-18水分離;
(2) 1號瓶的K2CO3/K2.2.2乙腈溶液將QMA上的18F–離子淋洗入第一反應管,通氮氣并115°C加熱共沸除水至干;
(3) 2號瓶中的無水乙腈加入第一反應管,重復共沸除水;
(4) 3號瓶中的前體加入干燥的第一反應管,110°C加熱,密閉反應3 min;
(5) 8號瓶內(nèi)的硫酸銅溶液加到第二應管,以溶解管內(nèi)疊氮前體和抗壞血酸鈉,將 9號瓶內(nèi)的 0.3 mL乙醇與乙腈混合液溶解TBTA加到第二反應管內(nèi),通氣混勻至透明;
(6) 再次加熱第一反應管到 110°C,并通入氮氣,將V9、V10、V16和V14打開,第一反應管內(nèi)生成的 5-18F-戊炔由氮氣載帶入第二反應管,由Bio-Scan Hot-Cell放射性探測儀測量管內(nèi)放射性,待放射性達到平衡后,并閉模塊,在室溫下靜置15 min。
圖2 多功能模塊自動化點擊合成18F-Pen-peptide示意圖Fig.2 Schematics of the automated click chemistry synthesis of 18F-Pen-peptide on PET-MF-2V-IT-1.
(7) 啟動 HPLC純化程序,將第二反應管內(nèi)的產(chǎn)品轉移到 10號中轉瓶,用 7號瓶內(nèi) 4 mL 0.2%(V/V)甲酸水清洗反應瓶,并轉移到10號瓶。打開G0將10號瓶內(nèi)液體裝載到LOOP環(huán)中,啟動純化;首先用 0.2%(V/V)甲酸作流動相,流速為 6 mL/min,第 5、10、15、20 min后改為5%(V/V)、10%(V/V)、15%(V/V)、18%(V/V)乙腈含 0.2%(V/V)甲酸;流速不變,第30–35 min出現(xiàn)產(chǎn)品峰,打開V18,將產(chǎn)品收集到固相萃取瓶13號內(nèi)。
(8) 啟動固相萃取程序,先將 HPLC收集液與100 mL水混勻,將混合液壓出,產(chǎn)品被Sep-Pak C-18小柱吸附,用11號瓶內(nèi)水清洗C-18柱,最后用1.5 mL USP乙醇將產(chǎn)品從C-18柱上淋下進入收集瓶,用生理鹽水稀釋。
放射化學純度用 HPLC測量,流動相為18%(V/V)乙腈含0.2%(V/V)甲酸,分析柱為:Grace Alltima C-18,5 μm,10 mm′250 mm,流速為 1 mL/min,紫外波長210 nm,用LC/MS/MS分析產(chǎn)品的比活度和產(chǎn)品中K2.2.2的含量[10]。
常規(guī)方法在多孔板培養(yǎng)A549肺腺癌細胞中,分成化療組和對照組,前者系在培養(yǎng)板上每孔內(nèi)加入卡鉑注射液100 μL(25 mg/mL),混勻后置入溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后培養(yǎng)板每孔中加入18F-Pen-peptide 50 kBq/100 μL,置入溫箱中 60 min,測量A549肺腺癌細胞對18F-Pen-peptide的攝取率。
用流式細胞術Annexin V法定量檢測平行對照組和化療組細胞凋亡,應用Annexin V-fluos試劑盒進行 Annexin V-FITc(異硫氰酸熒光素)及碘化丙啶(PI)標記,用流式細胞儀檢測磷脂酰絲氨酸(PS)外翻,計算凋亡率。
可用于18F標記的炔類很多,Marik等[7]比較了三種氟標記炔的沸點,其中 5-18F-氟戊炔的沸點為76°C,與乙腈相近,較易蒸出,本研究選用 5-18F-氟戊炔作鏈接劑。步驟如下:
第一步,在無水條件下經(jīng)K2.2.2催化,氟離子親核取代 6-OTs-戊炔上的甲苯磺?;?5-18F-氟戊炔。加熱并通入氮氣,將 5-18F-氟戊炔從 RV1蒸發(fā)到RV2中。因合成5-18F-氟戊炔時放射性活度高,無法直接測量從氟-18離子轉化成5-18F-氟戊炔的效率,從 RV2外置的放射性探頭估算,蒸餾到RV2的5-18F-氟戊炔合成效率約為51%。
全自動點擊合成的關鍵是自動合成 5-18F-氟戊炔,普通多功能合成模塊可合成 5-18F-氟戊炔,但不能將之蒸出。因其管線插到反應管底,以確保轉移全部液體。本模塊向反應管通入氮氣和向外輸送液體為同一管線,將排氣管線通過V9接到V10上,通過V10的開閉,將RV1內(nèi)氣體排到空氣中或排到RV2,達到除乙腈或蒸發(fā)5-18F-氟戊炔的目的。
第二步,在亞銅催化下,5-18F-氟戊炔與疊氮短肽前體發(fā)生點擊反應,如直接用亞銅就需氮氣保護,以防亞銅的氧化。本研究采用抗壞血酸鈉還原硫酸銅的方法,將硫酸銅溶液和抗壞血酸鈉分開放置,在5-18F-氟戊炔蒸餾前2 min混和,再加入TBTA后通入5-18F-氟戊炔,標記效率近99%(圖3),只有在Rt=27 min處有一小雜質峰。
圖3 半制備分離純化18F-Pen-peptide的放射性HPLC圖Fig.3 Semi-HPLC radio-chromatogram of purified18F-Pen-peptide.
經(jīng)HPLC分離后,采用本模塊配備的固相萃取程序,實現(xiàn)了全自動點擊合成。以74–92.5 GBq的氟-18離子為原料,經(jīng)HPLC純化和固相萃取,最終合成得到14.8–22.2 GBq的產(chǎn)品,其放射性活度足以滿足臨床 PET/CT顯像;合成效率為(21.0±4.5)%(n=6,未校正);所用時間為70 min,主要消耗在點擊合成(15 min)和HPLC純化(35 min),但該結果明顯優(yōu)于原來以18F-SFB合成18F-FB-RGD的結果[11](合成效率33.6%,不作校正為16.8%,耗時110 min)。
文獻[12]采用一鍋法點擊合成了幾個小分子化合物,即生成的18F-炔不從反應管內(nèi)蒸出,直接在同一反應管內(nèi)加入硫酸銅溶液、抗壞血酸鈉、TBTA疊氮前體,最終合成效率在10%–30%。如果能采用一鍋法點擊合成生物分子,則采用普通的F-18多功能合成模塊均可合成,目前未見文獻報道類似工作,本研究也未作該方面的嘗試。
圖4的HPLC分析表明,18F-Pen-peptide的放化純度大于 99%,同時共進的標準品(19F-Penpeptide)的UV保留時間表明,放射性峰與標準品在HPLC上的保留時間相同,證實放射性物質為18F-Pen-peptide。其 LC/MS/MS測量發(fā)現(xiàn)放射性峰處有一1153.6質量峰,同時有一強的1175.6質量峰;1153.6是19F-Pen-peptide的m/e的質量峰,而1175.6則為絡合了一個鈉離子的峰。
圖4 純化后的18F-Pen-peptide與標準品混進樣的HPLC放射性和UV譜Fig.4 UV & radio-chromatogram HPLC of 18F-Pen-peptide with standards.
采用 LC/MS/MS測量標記物中的19F-Penpeptide的含量,并與標準曲線比對,測得產(chǎn)品的比活度為 870 GBq/μmol。
采用LC/MS/MS測量產(chǎn)品中K2.2.2含量,低于LC/MS/MS的測量靈敏度(10 ng/mL),原因是采用蒸發(fā)法制備 5-18F-氟戊炔,在 RV2中幾乎不含K2.2.2,再經(jīng)HPLC純化,則K.2.2.2含量很低。
正常A549肺癌細胞與18F-Pen-peptide混合60 min后基本不攝取放射性,攝取率為(0.06±0.01)%,此時細胞凋亡率為(1.02±0.31)%;而經(jīng)卡鉑化療的腫瘤細胞對放射性的攝取值為(0.86±0.04)%,細胞凋亡率為(10.23±2.43)%??梢娀熀竽[瘤細胞凋亡增加,對18F-Pen-peptide放射性攝取也增加。
18F-Pen-peptide是含有DEVD核心的小分子肽,含DEVD的肽為細胞凋亡Caspase3的抑制劑,因此18F-Pen-peptide能與高表達Casepase3的凋亡細胞結合,放射性攝取值間接表達了細胞Caspase3的活性,從而表達了細胞凋亡的程度,18F-Pen-peptide與細胞凋亡的關系及動物 MicroPET顯像將在其他文章中進一步報告。
在修改后的 PET-MF-2V-IT-1型雙管多功能合成模塊上,以 5-OTs-戊炔為前體親核反應制備了5-18F-氟戊炔,加熱將之蒸餾到 RV2中,在亞銅催化下與疊氮前體發(fā)生點擊反應生成18F-Pen-peptide,最后經(jīng)HPLC純化和固相萃取得到放化純度高、比活度較高的凋亡顯像劑18F-Pen-peptide,總合成效率為(21.0±4.5)% (n=6,未校正),最終產(chǎn)品的放化純度為99%,比活度為870 GBq/μmol,合成時間為70 min。經(jīng)A549細胞攝取表明,未化療的腫瘤細胞基本不攝取放射性,卡鉑化療24 h后腫瘤細胞明顯攝取放射性,凋亡增加,放射性攝取也增加。18F-Pen-peptide是有潛在臨床應用價值的正電子肽類細胞凋亡顯像劑。
致謝感謝西門子公司分子影像部的張健教授為本研究提供了關鍵試劑。感謝北京派特科技有限公司的胡曉平工程師為模塊的修改提供了技術支持。
1 Zijlstra S, Gunawan J, Burchert W. Synthesis and evaluation of18F labeled recombinant annexin-V derivative for indentification and quantification of apoptotic cells with PET[J]. Appl Radiat Isot, 2003, 58(2):201–207
2 Wester H J, Hamacher K, Stocklin G. A comparative study of N.C.A Fluorine-18 labeling of protein via acylation and photochemical conjugation. Nucl Med Biol,1996, 23(3): 365–372
3 Speranza A, Ortosecco G, Castaldi E,et al. Fully automated synthesis procedure of 4-[18F]fluorobenzaldehyde by commercial synthesizer:Amino-oxi peptide labelling prosthetic group[J]. Appl Radiat Isot, 2009, 67(9): 1664–1669
4 劉曉飛, 張錦明, 田嘉禾, 等. 自動化合成 N-琥珀酰亞胺-4-[18F]氟苯甲酸酯[J]. 核化學與放射化學, 2008,30(1): 29–33 LIU Xiaofei, ZHANG Jinming, TIAN Jiahe,et al.Automatic synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [J]. J Nucl Radiochem, 2008, 30(1):29–33
5 Marik J, Hausner S H, Fix L A,et al. Solid-phase synthesis of 2-[18F]fluoropropionyl peptides[J].Bioconjugate Chem, 2006, 17: 1017–1021
6 Kolb H C, Finn M G, Sharpless K B. Click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions[J].Angew Chem Int Ed, 2001, 40(11): 2004–2021
7 Marik J, Sutcliffe J L. Click for PET: rapid preparation of[18F]fluoropeptides using CuIcatalyzed 1,3-dipolar cycloaddition[J]. Tetrahedron Lett, 2006, 47(37):6681–6684
8 Hausner S H, Marik J, Gagnon M K,et al. In vivo positron emission tomography (PET) imaging with an specic peptide radiolabeled using18F-"Click" chemistry:evaluation and comparison with the corresponding 4-[18F]fluorobenzoyl- and 2-[18F]fluoropropionylpeptides[J]. J Med Chem, 2008, 51(19): 5901–5904
9 張錦明, 張曉軍, 李云剛, 等. 雙管18F多功能合成模塊的研究[J]. 中華核醫(yī)學雜志, 2010, 50(6): 410–413 ZHANG Jinming, ZHANG Xiaojun, LI Yungang,et al.Research on multifunxtional18F–synthesis module with two vessels. Chin J Nucl Med, 2010, 50(6): 410–413
10 張曉軍, 李云剛, 劉健, 等. 液質聯(lián)用法測定常用 F-18藥物中Kryptofix 2.2.2的含量[J]. 同位素, 2011, 24(3):188–192 ZHANG Xiaojun, ZHANG Jinming, LIU Jian,et al.Measurement of Kryptofix 2.2.2 in F-18 radiopharmaceuticals by LC/MS/MS[J]. Isotope, 2011,24(3): 188–192
11 劉曉飛, 張錦明, 劉長濱, 等.18F-FB-RGD的自動化制備及其生物學評價[J]. 中華核醫(yī)學雜志, 2011, 31(1):50–53 LIU Xiaofei, ZHANG Jinming, LIU Changbin,et al.Automatic synthesis of18F-FB-RGD and evaluation of its biodistribution[J]. Chin J Nucl Med, 2011, 31(1): 50–53
12 Sirion U, Kim H J, Lee J H,et al. An efficient F-18 labeling method for PET study: Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition of bioactive substances and F-18-labeled compounds[J]. Tetrahedron Letters, 2007, 48(24):3953–3957