茍連平 呂 湛 王玉兵 李衛(wèi)東 胡龍江

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，盡管AS的發(fā)病機(jī)制多種，但公認(rèn)`有泡沫細(xì)胞的形成。當(dāng)單核/巨噬細(xì)胞被激活后，攝取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，吞噬大量脂質(zhì)而形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的生成和浸潤(rùn)是AS形成的關(guān)鍵。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體1(ABCA1)蛋白為跨膜糖蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為220×103，含有2 261個(gè)氨基酸，參與生物膜間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。羅格列酮可以促進(jìn)泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，減輕細(xì)胞泡沫化，從而防治AS和冠心病(CHD)。本課題以羅格列酮為參照，觀察松齡血脈康對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響，探求中藥松齡血脈康抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司。新生小牛血清，成都哈里生物工程有限公司。THP-1單核細(xì)胞株，四川大學(xué)免疫教研室。佛波脂(PAM)、羅格列酮為美國(guó)Sigma公司。鼠抗人單克隆ABCA1一抗，英國(guó)Abcam公司。FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝(原產(chǎn)于美國(guó))。松齡血脈康由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司惠贈(zèng)。油紅O，美國(guó)Amresco公司。BCA試劑盒，美國(guó)Pierce公司。超速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Culture Optima L-100 XP型。膽固醇檢測(cè)試劑盒，國(guó)產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 LDL的分離提取、氧化修飾及泡沫細(xì)胞模型建立、鑒定健康人血漿來(lái)自本院體檢健康者。①LDL的分離〔1〕:正常人新鮮血漿經(jīng)密度梯度超速離心，分離LDL。②LDL的氧化修飾:將上述透析好的LDL置于15μmol/L CuSO4溶液中透析氧化24 h，0.45μm的微孔濾器過(guò)濾，并用BCA法測(cè)定其濃度。③泡沫細(xì)胞模型建立、鑒定:含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基THP-1細(xì)胞。2～3代的THP-1細(xì)胞于含PAM 160 nmol/L，0.3%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。分化好的巨噬細(xì)胞，換液(含0.3%BSA的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基)，同時(shí)加入 50 mg/L ox-LDL，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用油紅O染色證實(shí)細(xì)胞中形成大量脂質(zhì)小滴，提示已轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。

1.2.2 藥品的配制 用DMSO分別將松齡血脈康、羅格列酮充分溶解，配制成實(shí)驗(yàn)濃度(通過(guò)MTT比色法確定)100倍的儲(chǔ)備液，－70℃保存，臨用前用培養(yǎng)液100倍稀釋，0.22μm的一次性濾器過(guò)濾除菌，4℃保存。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)方法 濃度為3×106/L的泡沫細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，分為3組。對(duì)照組(泡沫細(xì)胞液中無(wú)藥物干預(yù))、羅格列酮組、松齡血脈康組;每組設(shè)4個(gè)復(fù)瓶。同一濃度下羅格列酮(終濃度10μmol/L)、松齡血脈康組(終濃度0.81 mg/L，據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn))，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 6、12、24 h。同一時(shí)間(24 h)下，與不同濃度(1、10、20 μmol/L)的羅格列酮、不同濃度(0.40、0.81、1.6 mg/L)的松齡血脈康孵育。

1.2.4 ABCA1蛋白及細(xì)胞內(nèi)膽固醇檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ABCA1蛋白表達(dá)。氯仿-甲醇法提取培養(yǎng)液中的膽固醇。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示。組內(nèi)計(jì)量資料的比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用q檢驗(yàn)。兩組間計(jì)量資料的比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)羅格列酮對(duì)ABCA1蛋白表達(dá)及膽固醇的影響 泡沫細(xì)胞與0.81 mg/L的松齡血脈康、10μmol/L的羅格列酮作用6、12、24 h后，松齡血脈康組、羅格列酮組其ABCA1蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯增多，而細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量減少(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響(x ± s，n=4)

表2 不同濃度松齡血脈康、羅格列酮對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響(x ± s，n=4)

2.2 不同濃度松齡血脈康與羅格列酮對(duì)ABCA1蛋白及胞內(nèi)膽固醇含量的影響 泡沫細(xì)胞與0.40、0.81、1.6 mg/L的松齡血脈康，1、10、20μmol/L的羅格列酮作用24 h后，松齡血脈康組、羅格列酮組其ABCA1蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯增多，而細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

ABCA1蛋白是一種整合膜蛋白，利用ATP作為能量，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中和高密度脂蛋白生成的起始步驟中起著重要作用，被稱做膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的守門(mén)人。ABCA1蛋白功能障礙將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的沉積而成為泡沫細(xì)胞〔2，3〕，繼而浸潤(rùn)血管壁，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。相反，增加ABCA1蛋白的表達(dá)，則有利于促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出〔4，5〕，從而防治 AS和 CHD。松齡血脈康膠囊由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組成，3味中藥配伍具有平肝潛陽(yáng)、榮養(yǎng)陰血、鎮(zhèn)心安神的功效，有抗AS和CHD作用〔6〕，其機(jī)制是否也與ABCA1蛋白的增加有關(guān)，尚不清楚。

本研究說(shuō)明松齡血脈康、羅格列酮均能增加ABCA1蛋白的表達(dá)〔7〕。發(fā)現(xiàn)松齡血脈康組與羅格列酮組ABCA1蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異，這提示松齡血脈康與羅格列酮有相似的促進(jìn)ABCA1蛋白表達(dá)的作用。并發(fā)現(xiàn)松齡血脈康與羅格列酮均能降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，且兩者有相似的減輕泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇負(fù)荷的作用。行濃度及時(shí)間效應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，較大濃度、較長(zhǎng)時(shí)間的松齡血脈康增加ABCA1蛋白的表達(dá)更多、降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量更強(qiáng)。因此，松齡血脈康可通過(guò)促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，減輕細(xì)胞泡沫化，最終達(dá)到抗AS的作用，松齡血脈康有望成為中醫(yī)中藥領(lǐng)域中新型的抗AS的藥物。

1 何菊英，劉松青.一次性密度梯度超速離心分離人血清脂蛋白及無(wú)脂血清〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;24(1):46.

2 Brooks WA，Marcil M，Clee SM，et al.Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency〔J〕.Nat Genet，1999;22(4):336-45.

3 茍連平，呂 湛，秦 儉.ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1與動(dòng)脈粥樣硬化〔J〕.心血管病學(xué)進(jìn)展，2007;28(6):951-4.

4 Chinett G，Lestavel S，Bocher V，et al.PPAR-αand PPAR-γactivators induce cholesterol removal from human macrophage foam cells through stimulation ofthe ABCA1 pathway〔J〕.Nat Med，2001;7(1):53-8.

5 茍連平，呂 湛，秦 儉.腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其受控特點(diǎn)〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007;11(10):1943-6.

6 王 敏.松齡血脈康治療穩(wěn)定型心絞痛的療效觀察〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2002;17(6):466-7.

7 茍連平，秦 儉，呂 湛，等.羅格列酮對(duì)急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的干預(yù)〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009;34(6):718-21.