張云鶴 張一娜 劉 歆 王 立

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

阿爾茨海默病(AD)退行性改變可能由神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡引起。β淀粉樣蛋白(Aβ)是構(gòu)成SP的核心成分，對神經(jīng)元具有直接毒性作用，且被認(rèn)為是神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)因素，是AD的病因?qū)W事件。由于AD時產(chǎn)生較多的Aβ1-42，且Aβ各亞型中Aβ1-42毒性最強(qiáng)，對AD的發(fā)生及發(fā)展起著重要作用。因而，以Aβ1-42誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞建立穩(wěn)定的AD細(xì)胞模型最理想，并為從分子及細(xì)胞水平研究AD的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)一步探討新的治療途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法〔1～3〕

1.1 動物 新生24 h Wistar大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 試劑 DMEM/F12購自北京Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶消化液購自Beyotime公司，多聚賴氨酸及阿糖胞苷購自Sigma公司，B-27購自Gibco公司，Aβ1-42購自 Sigma公司，neurobasal購自 Gibco公司，AnnexinVFITC購自BD公司，青鏈霉素購自Beyotime公司，MTT購自Amresco公司，DMSO購自Amresco公司，NSE(即用型)購自武漢博士德公司，SABC及DAB購自武漢博士德公司，GAP-43購自Abcam公司，山羊抗小鼠IgG(tritc)及山羊抗兔IgG(FITC)購自Santa Cruz中杉公司分裝。

1.3 溶液配制 ①種植培養(yǎng)液:體積分?jǐn)?shù)83%DMEM/F12+15%胎牛血清+1%青鏈霉素+1%谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)。②維持培養(yǎng)液:體積分?jǐn)?shù)97%neurobasal+2%B27+1%谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)。③Aβ1-42用三蒸水配制成100μmol/L，過濾，分裝，－20℃凍存;使用前配制成所需濃度，并在37℃孵育7 d。

1.4 培養(yǎng)皿的預(yù)處理 0.01%多聚賴氨酸包被無菌培養(yǎng)瓶，4℃過夜，用0.01 mol/L PBS液洗凈置于無菌超凈臺自然晾干。1.5 原代培養(yǎng) 取出生24 h Wistar大鼠，用75%乙醇消毒，無菌條件下分離出海馬組織，置于冰浴PBS液中，小心剔除血管及筋膜，用PBS液沖洗干凈，剪成1 m3的組織塊(以上步驟均在冰上進(jìn)行)。加入適量37℃溫浴種植培養(yǎng)液，用火焰刨光的長玻璃吸管輕輕吹打成混懸液，以200目無菌不銹鋼網(wǎng)篩過濾，1 000 r/min離心5 min，以種植培養(yǎng)液重懸，計數(shù)后以2×106/ml密度接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)。24 h后全量換為維持培養(yǎng)液。72 h后加入阿糖胞苷溶液(終濃度為2.5 mg/L)，以抑制成纖維細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長，并半量更換培養(yǎng)液，此后每三天半量更換培養(yǎng)液。

1.6 實驗分組 將培養(yǎng)6 d的海馬神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，接種密度為1×104/孔，24 h后待細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞分為5組，加入Aβ1-42，使其終濃度分別為:A組，0μmol/L(對照組);B組，10 μmol/L;C 組，20 μmol/L;D 組，30 μmol/L;E 組，50μmol/L，并繼續(xù)培養(yǎng)行以下檢測。

1.7 MTT法測細(xì)胞活力 每組設(shè)3個平行樣本，取均值。96孔板分別培養(yǎng)72 h，每孔加入20μl MTT(濃度為5 mg/ml)，調(diào)零孔只加培養(yǎng)液。37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，以扣板法扣除液體，每孔再加入150μl DMSO，37℃振蕩10 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀上，以濾過波長570 nm，測各孔光吸收值(OD)。然后以O(shè)D值求細(xì)胞存活率。以對照組為參照，細(xì)胞存活率(%)=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.8 Annexin V/PI雙染法，流式細(xì)胞法檢測結(jié)果 將培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)細(xì)胞加入Aβ1-42，使其終濃度分別為A組，0μmol/L(對照組);B組，20 μmol/L;C組，30μmol/L;D 組，50μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后經(jīng)消化、重懸進(jìn)行Annexin V/PI雙染，并通過流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用單因素ANONA。統(tǒng)計由SPSS13.0軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變 接種后的海馬神經(jīng)細(xì)胞單個均勻分布，圓形，小而透亮，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞完成貼壁且部分已長出突起;至3 d時，細(xì)胞間已形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)，突起長度為胞體3～5倍，胞體呈多角形或橢圓形，周圍有光暈，胞體體積較大，透光性強(qiáng)，核大;培養(yǎng)至6 d，細(xì)胞樹突發(fā)達(dá)，相互連接形成致密的網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)元胞體飽滿，細(xì)胞生長成熟。見圖1。造模后的細(xì)胞可見較多凋亡細(xì)胞，胞體收縮、變形，甚至細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞壞死，細(xì)胞突起斷裂、消失，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)消失，細(xì)胞外基質(zhì)雜亂不清。見圖2。

圖1 生長7 d海馬神經(jīng)細(xì)胞(×400)

圖2 阿爾茨海默病細(xì)胞模型(×400)

2.2 Aβ1-42對細(xì)胞活力的影響 Aβ1-42濃度為10μmol/L時神經(jīng)細(xì)胞生存率(98.36±1.388 52)%較對照組(100%)未見明顯的下降;當(dāng)Aβ1-42濃度為20μmol/L時，細(xì)胞生存率較對照組出現(xiàn)明顯的下降〔(96.8±4.161 73)%，P＜0.05〕;Aβ1-42濃度增加到30μmol/L乃至50μmol/L時，下降更為明顯〔(64.02±0.822 8)%，(43.52 ±0.960 21)%，P ＜0.01〕。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 由流式結(jié)果可見，Aβ1-42濃度為20μmol/L時，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死率僅為7%;當(dāng)濃度增加到30μmol/L時，細(xì)胞生存狀態(tài)出現(xiàn)明顯變化，凋亡及壞死率增加明顯，可達(dá)40%以上;濃度繼續(xù)增加至50μmol/L時，細(xì)胞凋亡率無顯著增加，而繼發(fā)性壞死卻明顯增加(由24.4%上升至40.3%)。

3 討論

AD是多因素、多途徑共同作用的復(fù)雜病程，Aβ對AD發(fā)病具有密切關(guān)系，不僅既可以增強(qiáng)和放大各種傷害性刺激，又具有直接的細(xì)胞毒性。Aβ是β淀粉樣前體蛋白(APP)的正常代謝產(chǎn)物。APP是由695～770個氨基酸組成的跨膜蛋白，在腦內(nèi)經(jīng)Aβ源途徑加工產(chǎn)生39～43個氨基酸的Aβ片段。其中由42～43個氨基酸組成的蛋白質(zhì)片段，稱Aβ1-42，主要存在于AD患者的腦組織中〔4〕。通過對AD轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn)Aβ沉積、斑塊周圍的神經(jīng)炎改變、突觸缺失等典型的病理改變亦成為Aβ對AD發(fā)病機(jī)制作用的證據(jù)。細(xì)胞凋亡是引起AD腦組織神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一，同時，Aβ也可以通過壞死途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷〔5〕。因此，利用Aβ建立良好而穩(wěn)定的AD細(xì)胞模型有助于從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步研究AD的發(fā)病機(jī)制。

目前建立AD細(xì)胞模型以原代培養(yǎng)神經(jīng)元、神經(jīng)嵴源細(xì)胞為主，其次為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、基因工程細(xì)胞及雜交組織細(xì)胞等?，F(xiàn)已有充分的證據(jù)表明AD的認(rèn)知功能障礙與海馬神經(jīng)元大量丟失密切相關(guān)，且原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)實驗成本低，重復(fù)性高，故用以建立AD細(xì)胞模型代表性及實驗性更強(qiáng)。研究表明，長片段的Aβ1-42比Aβ1-40更易形成不溶性聚集體，神經(jīng)毒性更強(qiáng)〔6〕。因此，以Aβ1-42誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞是體外研究AD的理想細(xì)胞模型。

本研究提示隨著濃度的增加，神經(jīng)元的凋亡及繼發(fā)性死亡增加。凋亡與壞死是細(xì)胞死亡的兩種方式，正常體外培養(yǎng)細(xì)胞生長到一定時間可發(fā)生自主性凋亡和繼發(fā)性死亡，60 h內(nèi)凋亡率＜9.3%，死亡率＜3.7%〔7〕。流式結(jié)果提示細(xì)胞毒性作用不明顯。濃度增加至30μmol/L時，凋亡率及繼發(fā)性死亡率明顯增高凋亡及壞死率達(dá)40%，可見此濃度Aβ1-42已顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。濃度繼續(xù)增加至50μmol/L，存活細(xì)胞下降至50%以下，提示藥物濃度過大，不宜用以造模。Annexin-V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對磷脂酰絲氨酸(PS)有高度的親和性，細(xì)胞凋亡及壞死時PS均可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，因此僅靠傳統(tǒng)的Annexin-V染色無法區(qū)分凋亡和壞死;PI可以進(jìn)入破損細(xì)胞膜內(nèi)與降解DNA結(jié)合，因此，二者聯(lián)合應(yīng)用可以區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡及繼發(fā)性壞死〔8〕。Aβ1-42濃度為20μmol/L時早期凋亡細(xì)胞較少，且晚期凋亡及死亡細(xì)胞可能為自發(fā)性而非繼發(fā)性;當(dāng)濃度增加到30μmol/L時，出現(xiàn)明顯的凋亡及壞死;濃度繼續(xù)增加到50μmol/L時，細(xì)胞早期凋亡增加不明顯，而晚期凋亡及壞死明顯增加。

本實驗對以往海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法進(jìn)行了改良，未加入胰酶進(jìn)行消化，僅以刨光長玻璃吸管輕輕吹打，繼而以200目無菌不銹鋼網(wǎng)篩過濾，離心棄上清后以種植培養(yǎng)液接種。傳統(tǒng)方法均以胰蛋白酶消化繼而吹打，由于消化時間及溫度不易把握，且胰蛋白酶加入至組織懸液后的終濃度對消化效果亦有影響，極易造成消化過度或不充分。且消化后繼續(xù)吹打易損傷神經(jīng)細(xì)胞，影響接種后細(xì)胞生長。應(yīng)用胰蛋白酶將增加一次離心步驟，此亦可能造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷。所以，取消胰蛋白酶消化，大大降低了細(xì)胞受損可能，且吹打更為均勻，有助于細(xì)胞生長。本實驗中經(jīng)多次嘗試，發(fā)現(xiàn)2×106/ml接種密度細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，易貼壁且適合細(xì)胞生長。

綜合統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)、流式結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Aβ1-42濃度30μmol/L，作用時間72 d條件下培養(yǎng)的細(xì)胞會出現(xiàn)明顯的凋亡特征，可作為較理想的AD細(xì)胞模型，繼而可以為從分子水平及細(xì)胞水平研究探索AD的發(fā)病機(jī)制及開拓新的治療途徑提供了理想的研究載體，具有極大的經(jīng)濟(jì)和社會價值。

1 王 英，苗建亭，李柱一.β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡方式的研究〔J〕.中華老年心血管病雜志，2006;8(2):129-32.

2 蘇萬東，吳承遠(yuǎn)，劉 然，等.海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)的實驗研究〔J〕.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2002;1(3):269-70.

3 杜怡峰，張 晨.新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002;38(1):55-6.

4 Andreasen N，Blennow K.CSF biomarkers for mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease〔J〕.Clin Neurol Neurosurg，2005;107(3):165-73.

5 劉春喜，景愛紅.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒作用〔J〕.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004;27(1):64-7.

6 Bush A，Tanzi RE.The galvanization of beta-amyloid in Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(11):7317-9.

7 王亞利，宋天保，路 明，等.Aβ誘導(dǎo)PC212細(xì)胞凋亡建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型〔J〕.西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002;23(2):129-32.

8 黃 健，沈永生，周宏平，等.AnnexinV/PI、TdT和PI法檢測細(xì)胞凋亡的比較〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000;20(4):387-8.