劉明遠 楊光遠 王躍新 張春斌 白 雪 張建華

(佳木斯大學(xué)藥理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

褪黑素(Melatonin，MT)，是由哺乳動物和人松果體分泌的一種胺類激素，主要經(jīng)細胞色素(CY)P1A2和CYP2C19代謝，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗應(yīng)激、抗衰老、增強免疫、抗腫瘤等作用〔1～3〕。明確MT對CYP450酶各亞型的影響，對了解其與臨床其他藥物的相互作用、指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。關(guān)于MT對肝微粒體酶活性影響的研究，國內(nèi)外文獻鮮見報道。本課題組前期實驗結(jié)果表明，MT對大鼠CYP450含量和CYP1A2、CYP2C19活性無影響。本研究應(yīng)用甲苯磺丁脲、異喹胍和咪達唑侖為CYP450同工酶選擇性探針底物，進一步觀察MT對大鼠肝微粒體CYP450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的誘導(dǎo)和/或抑制作用，為臨床用藥及相關(guān)實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，清潔級，體重180～250 g〔購自佳木斯大學(xué)實驗動物中心，合格證號:SYXK(黑)2006-004〕。

1.1.2 主要試劑與儀器 MT(含量＞98%，多多藥業(yè)有限公司);甲苯磺丁脲、4'-羥基甲苯磺丁脲、異喹胍、4'-羥基異喹胍、咪達唑侖、1'-羥基咪達唑侖(Sigma公司);Aligent 6310質(zhì)譜儀、Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);752型紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 健康Wistar大鼠24只，雄性，隨機分成三組，每組8只。對照組，灌胃給予生理鹽水，連續(xù)給藥7 d;MT給藥組，每日灌胃給予MT(0.54 mg/kg)，連續(xù)給藥7 d;苯巴比妥誘導(dǎo)組，自MT給藥組給藥的第5天開始每日腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 肝微粒體的制備 動物拉頸椎處死，取出肝臟，立即放于冰冷的0.25 mol/L蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至無血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機制成勻漿;4℃20 000 r/min離心20 min，上清液100 000 r/min離心60 min，沉淀用0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)懸浮均勻，保存于－80℃。

1.2.3 蛋白濃度測定 依據(jù)Lowry等方法〔4〕測定。取牛血清白蛋白標準溶液，與銅試劑、Folin phenol試劑反應(yīng)后，測750 nm吸收度，以蛋白濃度C對吸收度A進行線性回歸得標準曲線。肝微粒體樣品用0.5 mol/L NaOH稀釋適當倍數(shù)后同法操作，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.2.4 CYP2C9活性測定 選擇甲苯磺丁脲作為特異性底物，參照文獻方法，建立孵化體系及定量測定4'-羥基甲苯磺丁脲的分析方法〔5，6〕。孵化體系中含大鼠肝微粒體蛋白1.0 mg/ml、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、甲苯磺丁脲 30.0 μmol/L，以Tris-HCl緩沖液(pH7.4)定容至500μl，孵化體系中甲醇的終濃度為0.06%，孵化10 min，取樣100μl，加入到200μl冰冷的甲醇中終止反應(yīng)。樣品處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.5 CYP2D6活性測定 選擇異喹胍作為其特異性底物，參照文獻方法建立定量測定4'-羥基異喹胍的分析方法〔7〕，孵化體系同1.2.4，異喹胍濃度為50μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為0.1%。樣品處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.6 CYP3A4活性測定 選擇咪達唑侖作為其特異性底物，參照文獻方法建立定量測定1'-羥基咪達唑侖的分析方法〔8〕，孵化體系同1.2.4，咪達唑侖濃度為100 μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為1%。樣品經(jīng)處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料采用x±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

以各探針藥物的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率 (nmol·mg protein－1·min－1)作為酶活性指標。MT給藥組和對照組大鼠肝微粒體CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性見表1。兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)，說明MT對CYP2C9、CYP2D6、CXP3A4亞型活性沒有抑制或誘導(dǎo)作用。

表1 對照組、MT組 CYP2C9、CYP2D6及CYP3A4 活性(nmol·mg protein－1·min－1，x±s)

3 討論

MT是一種由松果體分泌的神經(jīng)激素，具有調(diào)節(jié)睡眠的作用，分泌規(guī)律呈夜峰晝谷。青春期后，分泌量隨年齡增長而逐漸下降〔9〕。到中老年時期，體內(nèi)分泌的MT水平明顯下降，從而使大多數(shù)中老年人倍受失眠之苦。失眠癥是臨床上一種常見的疾病，如果得不到有效地控制，可進一步發(fā)展為重度抑郁癥〔10〕。在改善睡眠方面，MT呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢，至今，仍有很多人選擇MT改善睡眠質(zhì)量。

藥物代謝性相互作用是指同時或先后序貫使用2種或2種以上藥物時，因代謝環(huán)節(jié)的影響導(dǎo)致療效增強或降低。多種藥物合用時，代謝性相互作用發(fā)生率高達藥物相互作用的40%，具有非常重要的臨床意義。代謝性藥物相互作用最常見的原因是CYP450的誘導(dǎo)和抑制。由于老年人除失眠外常合并其他軀體疾病，MT與其他藥物合用在老年人中較為常見。因此，研究MT對肝微粒體CYP450酶的影響具有十分重要的意義。CYP450酶根據(jù)其氨基酸序列不同分為不同亞型，人體主要有5 種CYP450 酶，即CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9 和CYP2C19。這5種CYP450酶可以代謝約99%的通過CYP450酶代謝的藥物〔11〕。本課題組前期實驗結(jié)果表明，MT對大鼠CYP1A2、CYP2C19活性無影響。為了更全面掌握 MT對CYP450酶的作用，本實驗進一步探討了 MT對肝微粒體CYP450酶CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響，為臨床安全聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

本試驗以0.54 mg/kg體重(相當于人體推薦用量)劑量的MT原料藥連續(xù)給大鼠灌胃 7 d，測定MT直接給藥對大鼠CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響。結(jié)果顯示:Wistar大鼠經(jīng)過MT處理后，與對照組比較，CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性均沒有變化，提示當MT與某些主要經(jīng)CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4代謝的藥物合用時，發(fā)生代謝性藥物相互作用的可能性較小。

利用探針藥物測定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析和比較不同個體中酶活性的差異，為臨床安全合理用藥提供科學(xué)依據(jù)〔12〕。本實驗分別以甲苯磺丁脲、異喹胍、咪達唑侖為CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的特異性底物，通過代謝產(chǎn)物的生成速度來評價酶的活性。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測靈敏度高、選擇性好，在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本試驗采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定4'-羥基甲苯磺丁脲、4'-羥基異喹胍和1'-羥基咪達唑侖含量，快速、靈敏、簡便。

1 王 萍，周 偉.褪黑素的生物學(xué)作用及研究進展〔J〕.國際兒科雜志，2007;34(1):69-72.

2 楊祖銘，馮 星，朱國際，等.褪黑素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)元特異性烯醇化酶的影響〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2007;33(1):40-2.

3 劉慧霞，劉 旬.褪黑素具有催眠效應(yīng)的研究〔J〕.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校學(xué)報，2007;19(3):16-7.

4 Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent〔J〕.J Biol Chem，1951;193(1):265-75.

5 Zhang S，Song N，Li Q，et al.Liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous evaluation of activities of five cytochrome P450s using a five-drug cocktail and application to cytochrome P450 phenotyping studies in rats〔J〕.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008;871(1):78-89.

6 Maliakal PP，Coville PF，Wanwimolruk S.Tea consumption modulates hepatic drug metabolizing enzymes in Wistar rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2001;53(4):569-77.

7 Stewart NA，Buch SC，Conrads TP，et al.A UPLC-MS/MS assay of the“Pittsburgh cocktail”:six CYPprobe-drug/metabolites from human plasma and urine using stable isotope dilution〔J〕.Analyst，2011;136(3):605-12.

8 Dostalek M，Macwan JS，Chitnis SD，et al.Development and validation of a rapid and sensitive assay for simultaneous quantification of midazolam，1'-hydroxymidazolam，and 4-hydroxymidazolam by liquid chromatography coupled to tandem mass-spectrometry〔J〕.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010;878(19):1629-33.

9 周宇紅，嚴衛(wèi)星，馮曉蓮.褪黑素改善小鼠睡眠作用的研究〔J〕.中國食品衛(wèi)生雜志，1997;9(4):27-8.

10 Dooley M，Spencer CM，Dunn CJ.Aceclofenac:areappraisal of itsuse in the management of pain and rheumatic disease〔J〕.Drugs，2001;61(9):1351-78.

11 Bertz RJ，Granneman GR.Use of in vitro and in vivo data toestimatethe likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions〔J〕.Clin Pharmacokinet，1997;32(3):210-58.

12 朱立勤，婁建石.細胞色素P450與藥物代謝的研究現(xiàn)狀〔J〕.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004;9(10):1081-4.