楊 玉 劉 莉 商 宇 張鵬霞

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)具有誘導人白血病HL-60細胞凋亡及細胞周期阻滯的作用〔1，2〕，但是其誘導凋亡的機制尚不完全清楚?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是化學性質活躍的含氧原子或原子團，具有強氧化能力〔3〕。本實驗采用流式細胞術及蛋白印跡技術，檢測 OA處理后 HL-60細胞caspase-9及ROS的表達水平，探討OA誘導的細胞凋亡的可能機制，為應用OA治療白血病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 人早幼粒系白血病HL-60細胞購自中國科學院上海細胞庫?？筩aspase-9抗體購自美國Oncogene公司，抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體為美國Santa cruz公司產(chǎn)品。二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)購于美國Molecular Probe公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 OA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，用含新生牛血清的RPMI 1640稀釋，配制成最終濃度800μmol/L的儲存液。常規(guī)方法配制蛋白質免疫印跡試劑。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組 HL-60細胞接種于培養(yǎng)瓶，加入含有胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。實驗設空白對照組與OA用藥組?？瞻讓φ战M:HL-60細胞培養(yǎng)于含0.05%DMSO的PRMI 1640培養(yǎng)基。OA用藥組:80μmol/L OA處理HL-60 細胞12 h、24 h和48 h。

1.2.3 流式細胞術觀察 HL-60細胞中 ROS的變化〔4〕DCFH-DA以DMSO溶解，磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至終濃度為50μmol/L，避光－20℃保存。實驗開始前24 h，接種細胞(空白對照組與用藥組)于6孔培養(yǎng)板，細胞密度達每孔5×105個。OA處理細胞12 h、24 h和48 h。PBS洗2次，離心收集細胞，加入DCFH-DA液，37℃孵育30 min后，PBS洗滌，流式細胞儀檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.4 細胞總蛋白的提取及caspase-9測定 分別收集對照組和OA用藥組細胞。冷PBS洗滌，PBS重懸細胞并轉移細胞至EP管，加入細胞裂解液，冰浴，離心，取上清，蛋白濃度經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法測定。煮沸使蛋白變性，等量蛋白(50μg)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離(β-actin，caspase-9:15%)。轉移蛋白至硝酸纖維素膜(NC膜)，封閉后加適量滴度一抗 (β-actin，1∶500;caspase-9，1∶500)，4℃輕搖過夜。加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)漂洗，Western Blotting Luminol Reagent化學發(fā)光法曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析 以SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用完全隨機設計資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 OA對HL-60細胞caspase-9蛋白表達的影響 42 kD分子量的β-actin蛋白為上樣量對照。不同時間的OA作用于HL-60細胞后，46 kD分子量的前caspase-9隨時間的增加而減少，這意味著降解后有活性的caspase-9在逐漸增加。見圖1。

2.2 流式細胞術檢測OA處理HL-60細胞后ROS水平 以用藥組與對照組的DCFH熒光強度百分比來表示 ROS的水平。結果顯示，80μmol/L OA能誘導HL-60細胞產(chǎn)生ROS，且隨時間的延長而逐漸增加，在48 h ROS達到最高值。見圖2～圖4。

圖1 各組HL-60細胞caspase-9蛋白的表達

圖2 OA處理HL-60細胞12 h ROS的流式細胞術分析

圖3 OA處理HL-60細胞24 h ROS的流式細胞術分析

圖4 OA處理HL-60細胞48 h ROS的流式細胞術分析

3 討論

在深入研究細胞凋亡調控機制與信號通路的過程中，以線粒體為核心的凋亡信號通路日益得到人們重視。線粒體及相關凋亡因子可以作為新型藥物的潛在作用靶點，為疾病(尤其是腫瘤)的治療提供新的策略〔5〕。線粒體凋亡信號通路被活化的關鍵事件是caspase-9的活化，caspase-9激活下游caspase-3，從而激活caspase級聯(lián)反應，引起靶細胞凋亡。線粒體膜通透性改變的關鍵環(huán)節(jié)是線粒體膜通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)的開放，而 MPTP 的開放與細胞的氧化還原狀態(tài)，如ROS的堆積密切相關。ROS是真核細胞有氧呼吸時的產(chǎn)物，在線粒體電子鏈傳遞過程中，小部分氧不能被完全還原，生成了 ，并可進一步演化成H2O2、OH-。這些產(chǎn)物具有較強的氧化能力，統(tǒng)稱為ROS〔6〕。凋亡刺激因子使ROS水平輕度升高可能作為活化信號觸發(fā)線粒體凋亡信號通路，當?shù)蛲鰡雍螅琑OS進一步升高可能起加速凋亡的作用。

為了研究ROS在OA誘導HL-60細胞凋亡中的作用，本研究利用熒光探針DCFH-DA和流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS總體水平，此方法是實時觀察測定細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生變化的理想方法〔7〕，觀察到OA作用HL-60細胞12 h后ROS水平急劇上升，說明HL-60細胞在OA的作用下，細胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)被打破。HL-60細胞ROS水平在0～48 h內(nèi)逐漸升高，在48 h達到最高峰，說明ROS水平與藥物作用時間有關。實驗過程中，還觀察到caspase-9隨著OA的作用時間延長而增加，提示OA對HL-60細胞線粒體凋亡信號通路具有干預作用。

綜合分析實驗結果，認為OA可以通過影響HL-60細胞ROS水平，改變線粒體膜通透性，介導促凋亡因子的釋放，誘導HL-60細胞的凋亡。細胞凋亡的信號轉導機制十分復雜，各個凋亡通路也并非獨立運轉而是彼此交錯、重疊，互相調控。除ROS外，bcl-2基因家族的某些成員也可以通過影響線粒體膜通透性，誘導細胞凋亡〔8，9〕。可以確定的是OA可以通過改變ROS水平，引起線粒體膜通透性的改變。但是，ROS通路是獨立發(fā)揮作用，還是與其他促凋亡成員相互協(xié)同發(fā)揮作用?如果OA是通過多個因素引起線粒體膜通透性改變，那么ROS通路的作用有多大?這些都有待于進一步的研究。

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2 張鵬霞，李鴻梅，陳 東，等.齊墩果酸誘導人白血病HL-60細胞凋亡及細胞周期阻滯〔J〕.中國病理生理學雜志，2008;24(10):1909-11.

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4 Avlasevich S，Bryce S，De Boeck M，et al.Flow cytometric analysis of micronuclei in mammalian cell cultures:past，present and future〔J〕.Mutagenesis，2011;26(1):147-52.

5 Bouchier-Hayes L，Lartigue L，Newmeyer DD.Mitochondria:pharmacological manipulation of cell death〔J〕.J Clin Invest，2005;115(10):2640-7.

6 Szibor M，Richter C，Ghafourifar P，et al.Redox control of mitochondrial functions〔J〕.Antioxid Redox Signal，2001;3(3):515-23.

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8 Bacsi A，Chodaczek G，Hazra TK，et al.Increased ROS generation in subsets of OGG1 knockout fibroblast cells〔J〕.Mech Ageing Dev，2007;128(11):637-49.

9 張鵬霞，薛芳喜，王迪迪.齊墩果酸對K562細胞bax、bcl-xL mRNA表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(21):2751-2.