徐 倩 周曉慧 曹 凱 牛成偉 王 冰

(承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000)

同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫氨基酸,為蛋氨酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物〔1〕。當(dāng)Hcy代謝紊亂時(shí),可誘導(dǎo)高同型半胱氨酸血癥。近年來,大量研究表明,高同型半胱氨酸血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素〔2〕。但是,Hcy致AS的機(jī)制目前仍不完全明確,多數(shù)研究認(rèn)為,Hcy導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是As發(fā)生的重要環(huán)節(jié),其中活性氧對內(nèi)皮一氧化氮(NO)系統(tǒng)的損傷尤為重要。本研究通過觀察Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)eNOS表達(dá)和NO含量的影響,探討Hcy致AS的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Hcy、四甲基噻唑氮藍(lán)(MTT)均購自Sigma公司,DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自 E.coli公司。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購自寶生物工程(大連)有限公司。Trizol購自invitrogen公司,DEPC購自德國amresco公司。瓊脂糖購自美國Uniche Co公司。NO測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 HERAcell 150型CO2孵育箱購自Heraeus公司,LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡購自Wetzlar GmbH公司,凈化工作臺購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司,PTC-100購自MJ RESEARCH,INC,紫外可見分光光度計(jì)(DU800)購自BECKMAN COULTER公司,紫外透射反射分析儀(ZF型)購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 HUVECs培養(yǎng)及分組 取健康剖宮產(chǎn)婦新生胎兒臍帶,PBS液沖洗干凈,用1∶1的0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%的胰酶-0.02%EDTA(V/V=1∶1)消化13 min,收集消化液,1 000 r/min離心10 min后,棄上清,用含20%胎牛血清、10μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基重懸,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液,待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),用0.125%胰酶-0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化傳代。實(shí)驗(yàn)用第2代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組如下:正常對照組、Hcy劑量組。正常對照組細(xì)胞加含20%胎牛血清、10μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基;Hcy劑量組細(xì)胞在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再分為 4組,分別加入2.5 mmol/L Hcy(H1)、5 mmol/L Hcy(H2)、10 mmol/L Hcy(H3)、15 mmol/L Hcy(H4)。

1.4 四甲基噻唑氮藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活性 原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),用0.125%胰酶-0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化,調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1.0×105個(gè)/ml,接種于96孔板,每孔200μl,待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),吸棄原培養(yǎng)液,每孔加入無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200μl,使細(xì)胞同步化。24 h后,按實(shí)驗(yàn)分組施加干預(yù)因素。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)只有培養(yǎng)液,無細(xì)胞的空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/ml MTT 20μl,培養(yǎng)4 h,吸棄上清液,每孔加入二甲基亞砜150μl。振蕩溶解后,用酶標(biāo)儀測定在波長490nm處各孔的吸光度值。

1.5 RT-PCR檢測不同濃度Hcy對HUVECs中eNOS mRNA表達(dá)的影響 將第2代 HUVECs細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于24孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。按實(shí)驗(yàn)分組施加干預(yù)因素后,每孔加入Trizol 300μl,提取各組細(xì)胞總RNA。按 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件為:30℃10 min,42℃30 min,99℃5 min,5℃5min。PCR反應(yīng)體系為 20 μl。eNOS上游序列為:5′CCAGCATCCCTACTCCCACCAG3′,下游序列為:5′CACCTCGGCTTCCACCTCTTG3′。β-actin上游序?yàn)?5′AGCGGGAAATCGTGCGTGAC 3′,下游序列為:5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC 3′。eNOS 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min,94℃變性 30 s,63℃退火 30 s,72℃延伸1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。最后10℃延伸10 min。β-actin的退火溫度為58℃。取5μl PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀觀察并攝取圖像。eNOS mRNA相對表達(dá)強(qiáng)度 =eNOSmRNA掃描值/β-actin掃描值。

1.6 硝酸還原酶法檢測各組HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量NO化學(xué)性質(zhì)活潑,在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為NO2-和 NO3-,而 NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-,利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-,通過顯色深淺測定其濃度的高低。吸取24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行測定,結(jié)果按下列公式計(jì)算:NO(μmol/L)= ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100μmol/L)×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Hcy對HUVECs細(xì)胞生長的影響 不同濃度Hcy作用于HUVECs 24 h后,MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,同型半胱氨酸低濃度(2.5 mmol/L)對正常細(xì)胞生長的抑制作用不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著濃度的增高(5～15 mmol/L),同型半胱氨酸可明顯抑制 HUVEC的生長(P＜0.01),見表1。

表1 不同濃度Hcy對HUVECs細(xì)胞活力的影響(x ±s,n=5)

2.2 不同濃度Hcy對HUVECs eNOS mRNA表達(dá)的影響 不同濃度Hcy作用于HUVECs 24 h后,與正常對照組比較,同型半胱氨酸低濃度(2.5 mmol/L)對eNOS mRNA影響不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。隨著同型半胱氨酸濃度的增高(5～15 mmol/L),同型半胱氨酸可明顯抑制eNOS mRNA的表達(dá),eNOSmRNA的表達(dá)產(chǎn)物明顯減少(P＜0.01),且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性(P＜0.01),見表2,圖1。

表2 不同濃度Hcy對HUVECs細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)的影響(x±s,n=5)

2.3 不同濃度Hcy對HUVECs生成NO的影響 不同濃度Hcy作用于HUVECs 24 h后,與正常對照組比較,HUVECs生成的NO減少(P＜0.01),且呈現(xiàn)劑量依賴性的關(guān)系(P＜0.01),見表3。

圖1 Hcy對HUVECs細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)的影響

表3 不同濃度Hcy對HUVECs生成NO的影響(x ±s,n=5)

3 討 論

近年來大量研究表明高同型半胱氨酸血癥是造成AS的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔3〕。內(nèi)皮是所有心血管危險(xiǎn)因素共同的靶點(diǎn),內(nèi)皮功能異常被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)因素,并被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的早期表現(xiàn)〔4〕。高同型半胱氨酸在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)過分蓄積時(shí),有直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞的作用。NO是檢測血管內(nèi)皮功能的指標(biāo)之一,它是內(nèi)皮源性血管舒張因子,可舒張血管,抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖和血小板聚集。NO在體內(nèi)經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化生成,NOS有三種亞型,神經(jīng)元型NOS,誘導(dǎo)型NOS,內(nèi)皮型 NOS(endothelial NOS,eNOS)〔5〕。 在血管調(diào)節(jié)功能中起決定作用的是eNOS。NO減少或生物利用度下降可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,使內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張功能受損,血管收縮因子反應(yīng)性增強(qiáng),誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。

本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度Hcy對HUVECs細(xì)胞生長的影響,發(fā)現(xiàn) Hcy劑量組(5～15 mmol/L),可明顯抑制HUVECs的生長。RT-PCR結(jié)果顯示,Hcy劑量組(5～15 mmol/L)與HUVECs作用24 h后,eNOS mRNA的表達(dá)明顯下降,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hcy處理的各劑量組HUVECs NO含量明顯降低,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。與正常對照組比較,2.5 mmol/L Hcy劑組的eNOS mRNA的表達(dá)水平無明顯變化,但NO的含量明顯降低,這說明NO的生成可能不僅受eNOS表達(dá)水平的影響,可能還受其他因素的影響,如eNOS失耦聯(lián),過多的活性氧可與NO發(fā)生反應(yīng)〔6〕。

綜上所述,Hcy可通過抑制eNOS的表達(dá),使eNOS活性降低,減少HUVECs內(nèi)NO的生成,進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮,誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。因此,可以推斷通過提高eNOS的表達(dá),增加eNOS的活性,進(jìn)而促進(jìn)NO的生成;NO的含量增加可使損傷的血管內(nèi)皮恢復(fù)功能,從而延緩和逆轉(zhuǎn)AS的發(fā)生和發(fā)展,本研究結(jié)果將為AS的藥物治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 高 娟,郭 力.同型半胱氨酸與動(dòng)脈硬化〔J〕.醫(yī)學(xué)研究與教育,2010;27(1):82-4.

2 耿學(xué)川,杜繼臣,李繼來,等.高同型半胱氨酸血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(8):82-4.

3 Garc ía-Pinilla JM,Espinosa-Caliani S,Jiménez-Navarro M,et al.Influence of 677 C→T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase on medium-term prognosisafter acute coronary syndromes〔J〕.Tex Heart Inst J,2007;34(2):142-7.

4 向 陽,加娜提,愛 華 .高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿一氧化氮和內(nèi)皮素1水平的變化:血管內(nèi)皮功能損傷驗(yàn)證〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007;2(41):8242-6.

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6 鮑曉梅,吳春芳,陸國平 .阿托伐他汀對同型半胱氨酸所誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能損傷的保護(hù)作用 〔J〕.心臟雜志,2010;22(3):332-7.