張金卷，杜 智，王毅軍，聶福華，朱爭(zhēng)艷

(天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是一種危重癥，病死率高，臨床缺乏有效的治療方法[1]。茵陳蒿湯出自《傷寒論》，由茵陳、梔子、大黃組成，具有舒肝利膽、退黃等作用，已廣泛應(yīng)用于臨床各種肝病[2-4]。筆者在以往研究基礎(chǔ)上[5.6]，以清熱利濕、涼血解毒、活血化瘀、理氣開(kāi)郁立法，組成保肝方劑加味茵陳湯，觀察含中藥血清對(duì)D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞體外損傷模型的作用，以探討本方劑保肝降酶、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的功效。

1 材料與方法

1.1中藥制備 加味茵陳湯(茵陳、梔子、大黃、三七、丹參、赤芍、生地、丹皮、白芍、柴胡)，以自動(dòng)煎藥包裝機(jī)制成湯劑，并制成每1 ml含2 g生藥的濃縮劑，置4 ℃ 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2含中藥血清的制備 Wistar健康成年大鼠20只購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所(合格證號(hào)：0001537)，體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分為兩組，每組10 只，制備藥物血清組大鼠禁食12 h，灌胃給予中藥加味茵陳湯，劑量為每kg體質(zhì)量30 g生藥[5]，2次/d，連續(xù)3 d，最后1次給藥后1 h內(nèi)乙醚麻醉，無(wú)菌條件下自下腔靜脈采血，靜置后離心20 min (3 000 r/min，4 ℃) 吸取血清。對(duì)照組大鼠給予相同體積生理鹽水，以相同方式采取血清作為對(duì)照。所取血清均于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3含中藥血清作用于體外肝細(xì)胞損傷模型 與上述實(shí)驗(yàn)大鼠同時(shí)購(gòu)進(jìn)的健康Wistar大鼠10只，雌雄不限，改進(jìn)Seglen膠原酶(IV型，Sigma)原位灌注法分離獲得肝細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性，以DMEM (GIBCO)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度106/ml，移入24孔培養(yǎng)板(2 ml/孔)于CO2培養(yǎng)箱(FORMA)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，各孔以確定劑量(25 mg/L)加入D-GalN[4](購(gòu)于由重慶醫(yī)科大學(xué)，相對(duì)分子質(zhì)量215.64，批號(hào)9902)。根據(jù)藥物血清濃度分為5組：A組為空白對(duì)照組，加入相同體積生理鹽水，B組為10%(v/v)對(duì)照組大鼠血清，C組加入5%藥物血清，D組加入10%藥物血清，E組加入15%藥物血清，各組均以正常大鼠血清補(bǔ)充血清濃度至15%，于培養(yǎng)1、3、6、12和24 h取培養(yǎng)上清液，以全自動(dòng)生化分析儀(TOSHIBA 120-RF)測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)，同步測(cè)定肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)下觀察。

1.4肝細(xì)胞增殖活性測(cè)定-MTT反應(yīng) 以0.01 mol/L 的PBS配制0.5%(w/v) MTT(Sigma)溶液，調(diào)整pH值 7.2；上述24孔板細(xì)胞去掉上清液，補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)液至1 ml；加50 μl MTT溶液，37 ℃ 4 h以上；加0.04 mol/L的鹽酸-異丙醇，1 ml/孔，取上清液在酶標(biāo)儀570 nm測(cè)OD值。肝細(xì)胞活性率(%) =(測(cè)得OD值-對(duì)照OD值)/測(cè)得OD值

2 結(jié)果

2.1含中藥血清對(duì)體外損傷模型肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 經(jīng)10次細(xì)胞分離試驗(yàn)，肝細(xì)胞平均產(chǎn)量為(8.92±0.47)×108/只， 臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活性率96.23%±2.41%。新鮮分離的肝細(xì)胞呈單個(gè)游離狀態(tài)，包膜完整，見(jiàn)圖1。A、B組肝細(xì)胞逐漸出現(xiàn)腫脹，部分細(xì)胞胞膜不完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散甚至破損，見(jiàn)圖2，隨時(shí)間延長(zhǎng)加重。C組細(xì)胞損傷相對(duì)輕，D、E組細(xì)胞胞膜破壞不明顯，見(jiàn)圖3，且細(xì)胞有聚集趨勢(shì)，隨劑量增加及時(shí)間延長(zhǎng)和對(duì)照組區(qū)別更顯著。

圖1 正常大鼠肝細(xì)胞(×100)細(xì)胞損傷模型(×100) 圖2 A組大鼠肝 圖3 D組大鼠肝細(xì)胞損傷模型(×100)

2.2含中藥藥物血清對(duì)體外損傷模型肝細(xì)胞肝功能生化指標(biāo)影響 從各時(shí)間點(diǎn)觀察，隨含中藥血清濃度的增加，肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT、AST、LDH水平逐漸下降，10%藥物血清與15%藥物血清劑量組之間在各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1-3。

2.3含中藥藥物血清對(duì)體外損傷模型肝細(xì)胞增殖活性影響 從各時(shí)間點(diǎn)觀察，隨含中藥血清濃度的增加，培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖活性升高，見(jiàn)表4。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為ALF 屬于中醫(yī)黃疸中危重證候“急黃”的范疇，長(zhǎng)期以來(lái)中醫(yī)治療急性肝衰竭總結(jié)了大量寶貴經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)臨床學(xué)家對(duì)復(fù)雜、嚴(yán)重疾病往往采用多法聯(lián)合應(yīng)用，具有協(xié)同增效作用[7]。

茵陳蒿湯方中茵陳為君藥，具有清熱利濕、退黃功效，現(xiàn)代研究表明具有保肝利膽、抗炎等作用；佐梔子通利三焦，導(dǎo)濕熱下行，大黃具有通腑導(dǎo)濁、排毒祛瘀的功效，可清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，具有抗炎、增強(qiáng)免疫等作用，防治ALF；赤芍、丹參、三七具有活血化瘀功效，可加強(qiáng)茵陳退黃、降酶功效，起到改善微循環(huán)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、退黃降酶作用；加用清熱涼血藥物生地、丹皮等，調(diào)節(jié)肌體免疫功能；柴胡為引經(jīng)藥，具有舒肝理氣功效，可減輕肝損傷時(shí)肝細(xì)胞變性、壞死，促進(jìn)肝再生及白蛋白合成[2-4，6]。以上諸藥協(xié)同可能具有以下作用：減輕肝細(xì)胞壞死和線粒體損傷，防止脂肪變性，利膽退黃，恢復(fù)肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞再生；通過(guò)阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的破壞，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高細(xì)胞的氧化吸收代謝，有助于肝細(xì)胞功能的恢復(fù)；提高超氧化物歧化酶的活性，有抗超氧陰離子對(duì)肝細(xì)胞損傷的作用。

表1 含中藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷體外模型ALT影響 U/L

表2 含中藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷體外模型AST影響 U/L

表3 含中藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷體外模型LDH影響 U/L

表4 含中藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷體外模型MTT影響 U/L

含中藥血清藥理學(xué)方法是由日本學(xué)者于20世紀(jì)80年代首先提出的，是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液分離血清，用此含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究的一種方法[8]。其主要優(yōu)點(diǎn)有:①避免了中藥粗制劑直接加入反應(yīng)系統(tǒng)所帶來(lái)的干擾；②排除體外實(shí)驗(yàn)各種干擾因素的影響，可以較為清楚地認(rèn)識(shí)復(fù)方藥物中主要藥物的有效成分及活性部位；③采用含中藥血清培養(yǎng)細(xì)胞可以直接觀察中藥的藥物學(xué)效應(yīng)，真實(shí)地反映體內(nèi)血藥濃度及其變化；④操作相對(duì)簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低。

目前認(rèn)為制備含藥物血清的給藥方案及采血時(shí)間以盡量達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度時(shí)制備含藥血清為宜，給藥劑量應(yīng)以整體模型動(dòng)物的有效劑量(即臨床成人劑量的8～18倍量)為妥；理想的采血時(shí)間應(yīng)在血藥濃度的高峰期。雖不同學(xué)者存在分歧，但一般認(rèn)為含藥物血清藥效多次給藥明顯優(yōu)于單次給藥?；谥嗅t(yī)臨床用藥習(xí)慣和藥代動(dòng)力學(xué)的“平均穩(wěn)態(tài)濃度”概念考慮，中醫(yī)臨床遣方一般用藥3～4劑，分2次口服，藥物既可達(dá)到平均穩(wěn)態(tài)濃度，又能看到其明顯的療效[8.9]。本研究結(jié)合前述研究結(jié)果選擇10倍成人劑量[6]，采用每日給藥2次，連續(xù)給藥3 d，末次給藥后1 h采血的方案，所得血清以不同濃度加入肝細(xì)胞體外損傷模型，結(jié)果從培養(yǎng)期間各時(shí)間點(diǎn)看，隨含中藥血清濃度的增加各指標(biāo)水平逐漸下降，A(空白對(duì)照)、B(正常大鼠血清對(duì)照)兩組及B、C(5%含藥物血清)兩組在1 h 時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，D(10%含藥物血清)與E(15%含藥物血清)劑量組之間在各時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均有顯著性(A組與B組在各時(shí)間點(diǎn)P<0.05，余均為P<0.01)，而培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖活性(MTT反應(yīng))水平逐漸升高，可以說(shuō)明此方案所得含中藥血清可改善肝細(xì)胞體外損傷模型的肝功能指標(biāo)，減輕肝細(xì)胞損傷，改善培養(yǎng)肝細(xì)胞的增殖活性，以10%含中藥血清濃度最為理想，從細(xì)胞水平說(shuō)明本方劑具有防止肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。

1 Craig D G,Lee A,Hayes P C,etal.Review article: the current management of acute liver failure. Aliment Pharmacol Ther，2010，31(3):345

2 慕永平,劉平,王磊.茵陳蒿湯的發(fā)展及現(xiàn)代研究.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006, 12(2):67

3 李曉倩,王光耀,王興華.茵陳蒿湯臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.中醫(yī)藥臨床雜志，2009，21(1):82

4 吳建新,陳德忠.加味茵陳蒿湯治療肝癌術(shù)后黃疸. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006,16(3):160

5 張金卷,杜智,李濤,等.大鼠肝細(xì)胞分離及體外損傷模型建立.天津藥學(xué),2008，20(5):1

6 張金卷,杜智,張淑萍,等.加味茵陳湯防治大鼠急性肝功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2007,13(6):559

7 郭麗麗,王階論.中藥復(fù)方藥效研究.中國(guó)中藥雜志，2008，7(33):851

8 王國(guó)佐,葛金文.血清藥理學(xué)方法在中藥研究中的進(jìn)展.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(3):78

9 沈映君主編.中藥藥理學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:75