蘆 珂

（四川省雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川 雅安 625000）

為了篩選性狀優(yōu)良的多種菌株，開(kāi)發(fā)出多種效果優(yōu)良的微生態(tài)制劑，本試驗(yàn)針對(duì)乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌的生物拮抗作用，進(jìn)行微生態(tài)制劑菌種篩選的第一步工作，即體外試驗(yàn)，以判斷候選菌是否表現(xiàn)出對(duì)病原菌的拮抗作用，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 培養(yǎng)皿、移液管、牛津杯、微型發(fā)酵管（空管）、針頭、試管、蒸餾水、三角棒、微量加樣槍槍頭、注射器、離心管等器具，均已作高壓濕熱滅菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 LBS乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基的制備：蛋白胨2 g、牛肉膏2 g、酵母浸膏1 g、葡萄糖4 g、醋酸鈉1 g、吐溫-80 0.2mL、磷酸氫二鉀0.4 g、枸櫞酸三氨0.4 g、七水硫酸鎂0.04 g、四水硫酸鎂0.01 g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL?；旌弦陨铣煞?，加熱溶解、冷卻后，pH值調(diào)至6.0～6.5，121℃滅菌20min。

EMB培養(yǎng)基的制備：蛋白胨2 g、乳糖2 g、磷酸氫二鉀 0.4 g、伊紅 0.08 g、美藍(lán) 0.013 g、瓊脂粉 1.6 g、蒸餾水200mL。除伊紅、美藍(lán)外將其余成分混合于200mL水中，加熱溶解，調(diào)至pH為7.2，再分別加入伊紅、美藍(lán)混勻，121℃滅菌15min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：牛肉膏 1g、蛋白胨2g、氯化鈉1g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL。于200mL水中加入以上營(yíng)養(yǎng)成分，加熱煮沸使其溶解，調(diào)整pH值至7.6，121℃滅菌15min。成分中去除瓊脂粉即為營(yíng)養(yǎng)肉湯。

糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1g、吐溫-80 0.1mL、糖醇類（棉籽糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、山梨醇）各2 g、蒸餾水200mL。調(diào)pH值至7.0，滅菌后，加入1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL，然后分裝（無(wú)菌操作），制成含不同糖或醇的發(fā)酵管培養(yǎng)基。

七葉苷、精氨酸微量發(fā)酵管：購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌的分離純化 分別取豬糞、牛糞、雞糞約1 g，加99mL生理鹽水，室溫下150 r/min搖床振搖15～30min。分別在LBS培養(yǎng)基上劃線，將劃線的LBS培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗杏?7℃培養(yǎng)48h。觀察菌落生長(zhǎng)情況，取單一菌作純化劃線培養(yǎng)，連續(xù)純化3次。

1.2.2 菌種的鑒定 菌落和細(xì)菌形態(tài)的觀察：經(jīng)純化的菌株，劃線接種于相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上。把LBS培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗?7℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的情況。取單一菌落制涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢菌體形態(tài)特征。

生理生化鑒定：將純化的菌株接種于自制的微量發(fā)酵管及七葉苷、精氨酸微量發(fā)酵管中，連續(xù)觀察3 d。

1.2.3 大腸桿菌菌懸液的制備 取上述豬糞稀釋液在EMB培養(yǎng)基上劃線，然后置于37℃培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，取具有藍(lán)紫色金屬光澤的單一菌落作純化劃線培養(yǎng)，連續(xù)純化3次，并作革蘭氏染色，鏡檢菌體形態(tài)特征是否符合大腸桿菌的特征。將菌落特征和鏡檢結(jié)果明確并純化的大腸桿菌接種于50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床（150 r/min）培養(yǎng)24 h，然后對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)液稀釋100倍。

1.2.4 生物拮抗試驗(yàn) 將鑒定的菌株接種于50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，乳酸桿菌放入?yún)捬豕拗?7℃培養(yǎng)48h。取0.1mL稀釋好的大腸桿菌菌液到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌冷卻的三角棒涂布均勻，干燥15～30min。放置滅菌冷卻的牛津杯，每個(gè)平板放3個(gè)，一次到位。用吸管分別吸取乳酸桿菌上清液（3000 r/min，20min）以及乳酸桿菌全菌液，加滿牛津杯。置37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈大小，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌的分離純化結(jié)果 在LBS劃線培養(yǎng)的菌株中隨機(jī)挑選1株菌株，進(jìn)行純化培養(yǎng)，雞糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BJ、豬糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BZ、牛糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BN。

2.2 乳酸桿菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落特征及細(xì)菌形態(tài)特征 LBJ菌株在LBS培養(yǎng)基上呈乳白色、半透明、光滑、圓形的菌落。LBZ菌株和LBN菌株在LBS培養(yǎng)基上呈乳白色、光滑、圓形的菌落，較雞糞中分離的菌落略大。

LBJ菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，散在；LBZ菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，較LBJ菌株略大，散在；LBN菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，單個(gè)或成雙存在，菌體長(zhǎng)。

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果 3次重復(fù)的微量發(fā)酵管培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。除七葉苷、精氨酸外，接種前為灰色，接種后陽(yáng)性反應(yīng)為變黃，陰性為顏色不變。七葉苷接種前為淡紫色，陽(yáng)性反應(yīng)為黃色，陰性反應(yīng)為深紅色。以上微量發(fā)酵管除精氨酸外，其余都為糖、醇發(fā)酵，精氨酸發(fā)酵是為了驗(yàn)證有無(wú)氨氣產(chǎn)生，接種前為綠色，陽(yáng)性反應(yīng)為黃色，陰性反應(yīng)為紫色。

表1 微量發(fā)酵管培養(yǎng)結(jié)果

2.2.3 鑒定結(jié)果 根據(jù)菌落特征和細(xì)菌形態(tài)，3株菌都符合乳酸桿菌的特征。生化培養(yǎng)結(jié)果，查《伯杰氏手冊(cè)》，LBJ屬于發(fā)酵乳桿菌，LBZ屬于木糖乳桿菌，LBN屬于發(fā)狀乳桿菌。手冊(cè)中發(fā)酵乳桿菌在甘露糖項(xiàng)為弱反應(yīng)，實(shí)際觀察結(jié)果為陽(yáng)性；木糖乳桿菌在乳糖項(xiàng)為株間不同，實(shí)際觀察結(jié)果為陽(yáng)性；發(fā)狀乳桿菌在鼠李糖、山梨醇項(xiàng)未作試驗(yàn)，實(shí)際結(jié)果為陽(yáng)性。

2.3 生物拮抗試驗(yàn)結(jié)果 在生物拮抗試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有從雞糞中分離的乳酸桿菌（LBJ）對(duì)分離的大腸桿菌有拮抗作用，而從牛糞、豬糞中分離的乳酸桿菌沒(méi)有拮抗作用，具體見(jiàn)表2。在LBJ菌株的拮抗作用中，我們發(fā)現(xiàn)上清液的作用明顯大于全菌液，差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 乳酸桿菌的分離鑒定 孟軍、劉淑英等在分離和鑒定雞源乳酸桿菌時(shí)所用的方法是將增菌培養(yǎng)后的菌液在培養(yǎng)基上作劃線分離培養(yǎng)，從中選取各個(gè)形態(tài)不同的菌落，再進(jìn)行劃線分離和純化培養(yǎng)，最后得到多種乳酸桿菌菌株。劉立恒在乳酸桿菌分離前進(jìn)行了耐酸篩選和耐膽鹽篩選，這樣可以保證篩選出的菌株在腸道定植的可能性。本試驗(yàn)在對(duì)牛糞、雞糞、豬糞的乳酸桿菌分離純化中，每個(gè)樣品隨機(jī)傳代并純化一個(gè)生長(zhǎng)迅速的菌落，得到牛、雞、豬乳酸桿菌菌株各1株，再對(duì)其進(jìn)行形態(tài)和生化鑒定。

表2 生物拮抗試驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑：mm）

3.2 生物拮抗作用 本試驗(yàn)結(jié)果表明，來(lái)自牛、豬、雞的 3株乳酸桿菌（LBN、LBZ、LBJ）對(duì)豬源大腸桿菌有不同的作用。LBJ菌株對(duì)豬源大腸桿菌有拮抗作用，其余兩株沒(méi)有。而LBJ乳酸桿菌的培養(yǎng)上清液和全菌液對(duì)豬源大腸桿菌的拮抗作用效果亦不同。上清液的生物拮抗作用大于全菌液的生物拮抗作用，分析原因可能有：（1）就代謝產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，上清液純度、濃度大于全菌液；（2）由于分離了菌體，有可能黏度減小，擴(kuò)散能力增強(qiáng)；（3）由于在生物拮抗試驗(yàn)中沒(méi)有將培養(yǎng)基放在厭氧罐中，而乳酸桿菌為兼性厭氧菌，在氧濃度相對(duì)較高的條件下沒(méi)有產(chǎn)生乳酸，從而使試驗(yàn)結(jié)果受到影響；（4）在使用牛津杯的過(guò)程中，有可能菌體沉淀集聚在牛津杯的底部邊緣生長(zhǎng)，從而影響了代謝產(chǎn)物的滲透作用。

3.3 結(jié)論 此次試驗(yàn)分別從雞糞、牛糞、豬糞中分離純化出發(fā)酵乳桿菌、發(fā)狀乳桿菌、木糖乳桿菌；體外生物拮抗試驗(yàn)的結(jié)果是雞源發(fā)酵乳桿菌對(duì)豬源大腸桿菌有拮抗作用，而牛源發(fā)狀乳桿菌和豬源木糖乳桿菌對(duì)大腸桿菌沒(méi)有拮抗作用，且雞源發(fā)酵乳桿菌的上清液對(duì)大腸桿菌的拮抗作用大于全菌液。

[1]何明清.動(dòng)物微生態(tài)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1992.

[2]亦 云.乳酸菌類微生物制劑的作用機(jī)理及其應(yīng)用[DB].微生物特色學(xué)科信息門戶，2006，3（1）：34-38.

[3]郭興華.益生菌基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京科技出版社，2002：76-93.

[4]張 媛，毛玉杰.乳酸桿菌及其在微生態(tài)制劑中的作用[J].遼寧畜牧獸醫(yī)，2004，（2）：42-43.

[5]Pascual M，Hugas M，Badjola J I，et al.Lactobacillus salivarius CTC2197 prevents salmolella enteritidis cololization in chickens[J].Appl and environ Microbil，1999，65：4981-4986.

[6]王麗莉，陳其御.人陰道乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌的體外拮抗作用[J].江蘇醫(yī)藥，2005，31（9）：662-663.

[7]楊廷彬.LBS培養(yǎng)基的制法[Z].培養(yǎng)基手冊(cè).

[8]凌代文，等.乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1991.

[9]劉長(zhǎng)建，徐洪濤，權(quán)春善，等.乳酸菌素生產(chǎn)菌的分離與鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（7）：26-30.

[10]M.Garriga，M.Pascual，et al.Selection of Lactobacillus for chichen probiotic adjuncts[J].J Appl Microbil，1998，84：125-132.

[11]祝嫦巍，王昌祿，顧曉波，等.新型乳桿菌素產(chǎn)生菌的篩選及菌株特性的研究[J].氨基酸和生物資源，2002，24（1）：22-25.

[12]趙 斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[13]R.E.布瑞德，N.E吉本斯，等.乳酸桿菌屬的鑒定[A].伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（8版）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.