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        乳酸桿菌的分離、鑒定及體外拮抗試驗(yàn)

        2011-06-19 05:25:50
        四川畜牧獸醫(yī) 2011年11期
        關(guān)鍵詞:劃線乳酸桿菌豬糞

        蘆 珂

        (四川省雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系,四川 雅安 625000)

        為了篩選性狀優(yōu)良的多種菌株,開(kāi)發(fā)出多種效果優(yōu)良的微生態(tài)制劑,本試驗(yàn)針對(duì)乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌的生物拮抗作用,進(jìn)行微生態(tài)制劑菌種篩選的第一步工作,即體外試驗(yàn),以判斷候選菌是否表現(xiàn)出對(duì)病原菌的拮抗作用,為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 培養(yǎng)皿、移液管、牛津杯、微型發(fā)酵管(空管)、針頭、試管、蒸餾水、三角棒、微量加樣槍槍頭、注射器、離心管等器具,均已作高壓濕熱滅菌。

        1.1.2 培養(yǎng)基 LBS乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基的制備:蛋白胨2 g、牛肉膏2 g、酵母浸膏1 g、葡萄糖4 g、醋酸鈉1 g、吐溫-80 0.2mL、磷酸氫二鉀0.4 g、枸櫞酸三氨0.4 g、七水硫酸鎂0.04 g、四水硫酸鎂0.01 g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL?;旌弦陨铣煞?,加熱溶解、冷卻后,pH值調(diào)至6.0~6.5,121℃滅菌20min。

        EMB培養(yǎng)基的制備:蛋白胨2 g、乳糖2 g、磷酸氫二鉀 0.4 g、伊紅 0.08 g、美藍(lán) 0.013 g、瓊脂粉 1.6 g、蒸餾水200mL。除伊紅、美藍(lán)外將其余成分混合于200mL水中,加熱溶解,調(diào)至pH為7.2,再分別加入伊紅、美藍(lán)混勻,121℃滅菌15min。

        營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備:牛肉膏 1g、蛋白胨2g、氯化鈉1g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL。于200mL水中加入以上營(yíng)養(yǎng)成分,加熱煮沸使其溶解,調(diào)整pH值至7.6,121℃滅菌15min。成分中去除瓊脂粉即為營(yíng)養(yǎng)肉湯。

        糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1g、吐溫-80 0.1mL、糖醇類(棉籽糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、山梨醇)各2 g、蒸餾水200mL。調(diào)pH值至7.0,滅菌后,加入1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL,然后分裝(無(wú)菌操作),制成含不同糖或醇的發(fā)酵管培養(yǎng)基。

        七葉苷、精氨酸微量發(fā)酵管:購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 乳酸桿菌的分離純化 分別取豬糞、牛糞、雞糞約1 g,加99mL生理鹽水,室溫下150 r/min搖床振搖15~30min。分別在LBS培養(yǎng)基上劃線,將劃線的LBS培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗杏?7℃培養(yǎng)48h。觀察菌落生長(zhǎng)情況,取單一菌作純化劃線培養(yǎng),連續(xù)純化3次。

        1.2.2 菌種的鑒定 菌落和細(xì)菌形態(tài)的觀察:經(jīng)純化的菌株,劃線接種于相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上。把LBS培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗?7℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落的情況。取單一菌落制涂片進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢菌體形態(tài)特征。

        生理生化鑒定:將純化的菌株接種于自制的微量發(fā)酵管及七葉苷、精氨酸微量發(fā)酵管中,連續(xù)觀察3 d。

        1.2.3 大腸桿菌菌懸液的制備 取上述豬糞稀釋液在EMB培養(yǎng)基上劃線,然后置于37℃培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況,取具有藍(lán)紫色金屬光澤的單一菌落作純化劃線培養(yǎng),連續(xù)純化3次,并作革蘭氏染色,鏡檢菌體形態(tài)特征是否符合大腸桿菌的特征。將菌落特征和鏡檢結(jié)果明確并純化的大腸桿菌接種于50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中,置于37℃搖床(150 r/min)培養(yǎng)24 h,然后對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)液稀釋100倍。

        1.2.4 生物拮抗試驗(yàn) 將鑒定的菌株接種于50mL營(yíng)養(yǎng)肉湯,乳酸桿菌放入?yún)捬豕拗?7℃培養(yǎng)48h。取0.1mL稀釋好的大腸桿菌菌液到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,用滅菌冷卻的三角棒涂布均勻,干燥15~30min。放置滅菌冷卻的牛津杯,每個(gè)平板放3個(gè),一次到位。用吸管分別吸取乳酸桿菌上清液(3000 r/min,20min)以及乳酸桿菌全菌液,加滿牛津杯。置37℃溫箱中培養(yǎng)24h,觀察抑菌圈大小,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 乳酸桿菌的分離純化結(jié)果 在LBS劃線培養(yǎng)的菌株中隨機(jī)挑選1株菌株,進(jìn)行純化培養(yǎng),雞糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BJ、豬糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BZ、牛糞菌株代號(hào)為L(zhǎng)BN。

        2.2 乳酸桿菌的鑒定結(jié)果

        2.2.1 菌落特征及細(xì)菌形態(tài)特征 LBJ菌株在LBS培養(yǎng)基上呈乳白色、半透明、光滑、圓形的菌落。LBZ菌株和LBN菌株在LBS培養(yǎng)基上呈乳白色、光滑、圓形的菌落,較雞糞中分離的菌落略大。

        LBJ菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌,無(wú)芽孢,散在;LBZ菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌,無(wú)芽孢,較LBJ菌株略大,散在;LBN菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌,無(wú)芽孢,單個(gè)或成雙存在,菌體長(zhǎng)。

        2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果 3次重復(fù)的微量發(fā)酵管培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。除七葉苷、精氨酸外,接種前為灰色,接種后陽(yáng)性反應(yīng)為變黃,陰性為顏色不變。七葉苷接種前為淡紫色,陽(yáng)性反應(yīng)為黃色,陰性反應(yīng)為深紅色。以上微量發(fā)酵管除精氨酸外,其余都為糖、醇發(fā)酵,精氨酸發(fā)酵是為了驗(yàn)證有無(wú)氨氣產(chǎn)生,接種前為綠色,陽(yáng)性反應(yīng)為黃色,陰性反應(yīng)為紫色。

        表1 微量發(fā)酵管培養(yǎng)結(jié)果

        2.2.3 鑒定結(jié)果 根據(jù)菌落特征和細(xì)菌形態(tài),3株菌都符合乳酸桿菌的特征。生化培養(yǎng)結(jié)果,查《伯杰氏手冊(cè)》,LBJ屬于發(fā)酵乳桿菌,LBZ屬于木糖乳桿菌,LBN屬于發(fā)狀乳桿菌。手冊(cè)中發(fā)酵乳桿菌在甘露糖項(xiàng)為弱反應(yīng),實(shí)際觀察結(jié)果為陽(yáng)性;木糖乳桿菌在乳糖項(xiàng)為株間不同,實(shí)際觀察結(jié)果為陽(yáng)性;發(fā)狀乳桿菌在鼠李糖、山梨醇項(xiàng)未作試驗(yàn),實(shí)際結(jié)果為陽(yáng)性。

        2.3 生物拮抗試驗(yàn)結(jié)果 在生物拮抗試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),只有從雞糞中分離的乳酸桿菌(LBJ)對(duì)分離的大腸桿菌有拮抗作用,而從牛糞、豬糞中分離的乳酸桿菌沒(méi)有拮抗作用,具體見(jiàn)表2。在LBJ菌株的拮抗作用中,我們發(fā)現(xiàn)上清液的作用明顯大于全菌液,差異顯著(P<0.05)。

        3 討論與結(jié)論

        3.1 乳酸桿菌的分離鑒定 孟軍、劉淑英等在分離和鑒定雞源乳酸桿菌時(shí)所用的方法是將增菌培養(yǎng)后的菌液在培養(yǎng)基上作劃線分離培養(yǎng),從中選取各個(gè)形態(tài)不同的菌落,再進(jìn)行劃線分離和純化培養(yǎng),最后得到多種乳酸桿菌菌株。劉立恒在乳酸桿菌分離前進(jìn)行了耐酸篩選和耐膽鹽篩選,這樣可以保證篩選出的菌株在腸道定植的可能性。本試驗(yàn)在對(duì)牛糞、雞糞、豬糞的乳酸桿菌分離純化中,每個(gè)樣品隨機(jī)傳代并純化一個(gè)生長(zhǎng)迅速的菌落,得到牛、雞、豬乳酸桿菌菌株各1株,再對(duì)其進(jìn)行形態(tài)和生化鑒定。

        表2 生物拮抗試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑:mm)

        3.2 生物拮抗作用 本試驗(yàn)結(jié)果表明,來(lái)自牛、豬、雞的 3株乳酸桿菌(LBN、LBZ、LBJ)對(duì)豬源大腸桿菌有不同的作用。LBJ菌株對(duì)豬源大腸桿菌有拮抗作用,其余兩株沒(méi)有。而LBJ乳酸桿菌的培養(yǎng)上清液和全菌液對(duì)豬源大腸桿菌的拮抗作用效果亦不同。上清液的生物拮抗作用大于全菌液的生物拮抗作用,分析原因可能有:(1)就代謝產(chǎn)物來(lái)說(shuō),上清液純度、濃度大于全菌液;(2)由于分離了菌體,有可能黏度減小,擴(kuò)散能力增強(qiáng);(3)由于在生物拮抗試驗(yàn)中沒(méi)有將培養(yǎng)基放在厭氧罐中,而乳酸桿菌為兼性厭氧菌,在氧濃度相對(duì)較高的條件下沒(méi)有產(chǎn)生乳酸,從而使試驗(yàn)結(jié)果受到影響;(4)在使用牛津杯的過(guò)程中,有可能菌體沉淀集聚在牛津杯的底部邊緣生長(zhǎng),從而影響了代謝產(chǎn)物的滲透作用。

        3.3 結(jié)論 此次試驗(yàn)分別從雞糞、牛糞、豬糞中分離純化出發(fā)酵乳桿菌、發(fā)狀乳桿菌、木糖乳桿菌;體外生物拮抗試驗(yàn)的結(jié)果是雞源發(fā)酵乳桿菌對(duì)豬源大腸桿菌有拮抗作用,而牛源發(fā)狀乳桿菌和豬源木糖乳桿菌對(duì)大腸桿菌沒(méi)有拮抗作用,且雞源發(fā)酵乳桿菌的上清液對(duì)大腸桿菌的拮抗作用大于全菌液。

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