許端祥，高山，林碧英，傅睿清

（福建福州市蔬菜科學(xué)研究所，350111）

苦瓜（Momordica charantiaL.）為葫蘆科苦瓜屬一年生攀緣草本植物，起源于東南亞的熱帶地區(qū)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，在中國(guó)、印度、日本、東南亞都有悠久的栽培歷史。佳美苦瓜是福州市蔬菜科學(xué)研究所繼佳玉苦瓜[1]之后培育的苦瓜新品種，其母本是強(qiáng)雌系43-C，父本為自交系59-W。佳美苦瓜植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，分枝力強(qiáng)，早中熟，主蔓第一雌花著生8~12節(jié)，雌花率高；從開花到商品瓜成熟需15~20 d，商品瓜呈長(zhǎng)棒形，尾部鈍圓，瓜長(zhǎng)26~35 cm，橫徑5~7 cm，肉厚1.1 cm；瓜皮色綠有光澤，瓜面圓瘤與短縱瘤相間，瓜形美觀，成熟瓜不褪綠，肉質(zhì)甘脆微苦，品質(zhì)優(yōu)良，單瓜質(zhì)量400~500 g，667 m2產(chǎn)量3 000 kg左右。目前已在福建、廣東、湖北、四川等地示范推廣，表現(xiàn)反映良好，種植面積不斷擴(kuò)大。

隨著種植面積的擴(kuò)大，其用種量逐步增大，種子質(zhì)量的控制就顯得尤為重要。種子純度是種子質(zhì)量的主要指標(biāo)，種子純度的降低會(huì)明顯降低作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)作物品種的純度鑒定仍以形態(tài)指標(biāo)鑒定為主，其特點(diǎn)是準(zhǔn)確可靠，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能滿足當(dāng)年用種需要。為縮短鑒定周期，同工酶技術(shù)已應(yīng)用于瓜類蔬菜雜種純度的鑒定[2，3]，但同工酶多態(tài)性不夠豐富，同時(shí)有組織和器官特異性，大大降低了鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以發(fā)展與應(yīng)用。其中SRAP（sequence related amplified polymorphism）是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便，無需預(yù)先知道基因組信息，且具有豐富的多態(tài)性[4]。

本研究以佳美苦瓜及其親本為材料，采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，建立佳美苦瓜及其親本的DNA指紋圖譜，為其純度鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦瓜品種佳美及其親本均由福州市蔬菜科學(xué)研究所苦瓜課題組提供。采用穴盤育苗，待幼苗長(zhǎng)到2片真葉時(shí)取嫩葉待用。SRAP引物、Taq酶和dNTP等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

①DNA提取 以幼苗為材料，隨機(jī)抽取苦瓜品種佳美及其父母本各20株，剪取剛展開的健康嫩葉，于液氮中研磨，采用改良的CTAB法[5]提取總DNA，用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm下測(cè)定OD值，檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，并將其稀釋到30 ng/μL作為PCR擴(kuò)增的模板。

②PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)在PCR（Eppendorf Mastercyclergradient）儀上進(jìn)行。SRAP反應(yīng)參照Li等[4]的方法進(jìn)行。對(duì)9個(gè)上游引物（Me1~9）和12個(gè)下游引物（Em1~12）組成的108對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選。25 μL的反應(yīng)體系為：30 ng/μL DNA 模板，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L 引物，0.75 U Taq酶。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，35℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征引物的篩選

按Li等[4]提出的原則設(shè)計(jì)引物，選用上海生工生物工程有限服務(wù)公司合成的SRAP的9個(gè)上游引物（Me1~9）和 12 個(gè)下游引物（Em1~12）組成的 108 個(gè)引物組合對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增篩選。隨機(jī)提取佳美的父本、母本及F1代植株各20株，建立混合池，其中有2對(duì)引物擴(kuò)增的雜種譜帶與父本有差異；有2對(duì)引物擴(kuò)增的雜種譜帶與母本有差異。

2.2 指紋圖譜的建立

經(jīng)多次試驗(yàn)，篩選出2對(duì)特征引物Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）（圖 1）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）（圖 2），建立了佳美苦瓜的DNA指紋圖譜。篩選的2對(duì)特征引物能同時(shí)擴(kuò)增出F1代及其父母本的多態(tài)性條帶，其擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2 引物Me8-Em8佳美苦瓜和父母本基因組DNA的SRAP擴(kuò)增

圖1 引物Me6-Em9佳美苦瓜和父母本基因組DNA的SRAP擴(kuò)增

2.3 雜種純度的鑒定

將佳美雜交種種植于大田中，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，隨機(jī)抽取100株單株并編號(hào)，按上述方法提取 DNA，選用 2 對(duì)特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）進(jìn)行SRAP的分子鑒定。結(jié)果檢測(cè)出3株單株無父本特異帶只有母本特異帶，說明這3株植株是母本苗，雜交種的純度為97%。成株期鑒定植株的生物學(xué)性狀，發(fā)現(xiàn)3株與母本性狀一樣，雜交率為97%，與SRAP鑒定結(jié)果一致。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過優(yōu)化DNA提取程序，嚴(yán)格控制DNA模板質(zhì)量，優(yōu)化反應(yīng)體系。經(jīng)多次試驗(yàn)，篩選出2對(duì)特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'），建立了佳美苦瓜的DNA指紋圖譜。在生產(chǎn)田中隨機(jī)抽取單株并編號(hào)，苗期提取DNA進(jìn)行SRAP分子鑒定，試驗(yàn)結(jié)果與大田植株成株期的形態(tài)鑒定結(jié)果高度吻合，說明利用SRAP分子技術(shù)建立DNA指紋圖譜鑒定佳美品種的純度是可行的。

[1]高山，林碧英，許端祥，等.苦瓜新品種佳玉的選育[J].中國(guó)蔬菜，2010（18）：89-90.

[2]孟祥波，張鳳麗.同工酶技術(shù)在瓜類蔬菜上的應(yīng)用研究[J].上海蔬菜，2010（1）：19-20.

[3]閆世江，張繼寧，劉潔.同工酶技術(shù)在瓜類育種中的應(yīng)用[J].蔬菜，2010（8）：33-35.

[4]Li G,Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103(2):455-461.

[5]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：742-744.