曾振東 韋金育 曾翠瓊 楊增艷 陳 術(shù)

廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001

蛞蝓治癌來之民間經(jīng)驗，近年有關(guān)蛞蝓對肺癌的臨床與實驗報告表明其對腫瘤的生長確有一定抑制作用，［1－2］但其作用機理還不太清楚。本研究將通過蛞蝓提取物對人肺癌細胞凋亡的體外實驗，探討其抗癌作用機理。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

流式細胞儀為美國Backman coulter Epics XL型;Annexin V－FITC測定試劑盒為美國Backman公司產(chǎn)品。

1.2 蛞蝓提取物

實驗用蛞蝓采自南寧市郊區(qū)農(nóng)村，經(jīng)處理后用乙酸乙酯提取，冰箱保存?zhèn)溆?。蛞蝓原動物?jīng)廣西大學動物科學技術(shù)學院專家鑒定為腹足綱蛞蝓科野蛞蝓。

蛞蝓提取物的制備:稱取藥物49.53g，加入乙酸乙酯150ml，80℃回流1h，抽濾，殘渣重復回流一次，合并濾液，減壓干燥，濃縮成浸膏樣備用。用時1mg先用100uL甲基亞砜 (DMSO)溶解。加入900uL小牛血清培養(yǎng)液，配制成1mg/ml的工作液，即成本實驗所用藥液。對照組加入10%DMSO培養(yǎng)液。

1.3 細胞株及其培養(yǎng) 人肺癌細胞株A549由廣西醫(yī)科大學實驗中心提供。

細胞培養(yǎng)A549細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100kU/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPM1－1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 流式細胞光度術(shù)檢測細胞凋亡

(1)蛞蝓提取物處理的肺癌細胞和空白細胞，胰酶消化，吹打，移至離心管中1000rpm，離心5min。 (2)棄上清，拍打，加PBS 2ml，混勻后再離心1000rpm離心5min棄上清。(3)拍打細胞加Binding Buffer 500μl調(diào)整細胞濃度約為5x106cell/ml，置冰盒上。(4)取100μl樣本至試管中，加Annexin V－FITC 5μl，PI 2.5μl.反應(yīng)10min。(5)加450μl Binding Buffer.流式細胞儀檢測熒光強度，以分析靶細胞磷脂酰絲氨酸外化率。

2 結(jié)果

流式細胞儀檢測結(jié)合分析表明 (見圖1)，肺癌細胞A549與不同濃度藥物共同孵育24小時后，靶細胞的磷脂酰絲氨酸 (PS)，由細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，即出現(xiàn)PS外化。給藥組的PS外化率 (即凋亡細胞數(shù))高于空白對照組。不同濃度的藥物對細胞的影響各不相同，細胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。見表1。

表1 各實驗組細胞不同轉(zhuǎn)歸的百分比 (%)

4 討論

蛞蝓提取物可以抑制人體內(nèi)外腫瘤的生長，且無明顯毒副作用，是近年受人們關(guān)注的抗癌動物藥。但目前對蛞蝓抗癌的作用機制還不太了解。為了解蛞蝓抗癌機理，我們用蛞蝓提取物對人肺癌細胞凋亡的影響進行了實驗研究。我們通過流式細胞術(shù)檢測表明蛞蝓提取物能誘導A549細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達5.3～15.1%，細胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。研究結(jié)果提示，蛞蝓提取物對人肺癌細胞A549具有明顯的誘導凋亡作用。

細胞凋亡是一個由基因決定的自動結(jié)束細胞生命的過程。有專家認為惡性腫瘤是由于細胞增殖和細胞凋亡兩種作用相反的生命活動間失去了平衡，表現(xiàn)腫瘤細胞生長優(yōu)勢而形成的，因而細胞凋亡異常是腫瘤形成和發(fā)展的一個重要原因。［3～5］通過各種途徑和方式誘導、增強腫瘤細胞的凋亡有可能是抑制腫瘤細胞生長的一個重要因素，值得進一步探討。

［1］郭岳峰，王守章，焦智民等.蛞蝓膠囊治療晚期非小細胞肺癌32例療效觀察［J］.中醫(yī)研究，1994，7(3):24.

［2］謝金魁，曹建國.蛞蝓對人肺鱗癌、肺腺癌細胞抑瘤作用初探［J］.腫瘤防治研究，1997，24(6):344.

［3］王申五，武莎莎.凋亡與腫瘤 ［J］.中華腫瘤雜志，1999，21(4):308.

［4］甄永蘇.抗腫瘤藥物研究與開發(fā) ［M］.北京:化工出版社，2004:101.

［5］柳娜，殷志，莊英識等.蛞蝓糖蛋白提出多糖對肺腺癌作用的實驗研究［J］.臨床腫瘤學雜志，2008，13(9):779.