張玉保,董果雄△,郭琳琳,張社華,姚如永,馮培青

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院:1.附屬醫(yī)院心內(nèi)科,山東青島266003;2.附屬心血管病醫(yī)院,山東青島266071;3.實(shí)驗(yàn)中心,山東青島266071;4.附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

再狹窄(restenosis,RS)是影響經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)及支架置入術(shù)后遠(yuǎn)期療效的主要限制因素[1]。炎癥反應(yīng)在再狹窄尤其是支架置入術(shù)后再狹窄的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[2]。隨著對再狹窄分子機(jī)制研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)參與再狹窄過程中的許多炎性因子都受到核因子κ B(nuclear factor kappa B,NF-κ B)的調(diào)控,特別是多種黏附分子如P-選擇素、E-選擇素、VCAM-1、ICAM-1等。有研究發(fā)現(xiàn),全反式維A酸(al1-trans retinoic acid,AT RA)能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖信號傳導(dǎo)途徑而抑制平滑肌細(xì)胞增生[3-5],但對其在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中炎癥反應(yīng)的抑制作用卻報(bào)道較少。本研究通過建立兔頸動脈內(nèi)膜損傷模型,觀察AT RA對內(nèi)膜損傷后粥樣硬化病灶中內(nèi)膜增生的抑制作用,探討其可能的抗炎機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性新西蘭大白兔54只(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所),許可證號:SCXK(魯)20040013,體質(zhì)量(2.2±0.12)kg。AT RA(山東良福制藥有限公司)、膽固醇(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)、NF-κ B p65、P-選擇素多克隆抗體濃縮型(武漢博士德公司)、PV-6001二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋)、奧林巴斯 BX50顯微鏡、Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)等。

1.2 動物分組及模型制作 將54只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組,每組18只。假手術(shù)組(A、B、C組,n=6)和對照組(A、B、C組,n=6)和治療組(A、B、C組,n=6)。假手術(shù)組每日每只喂養(yǎng)150 g基礎(chǔ)飼料,對照組和治療組每日進(jìn)食150 g高脂飼料(6%豬油、1.5%膽固醇、92.5%基礎(chǔ)飼料),均自由飲水。喂養(yǎng)2周后假手術(shù)組分離暴露血管但不損傷內(nèi)膜,治療組和對照組行頸動脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù)[6-7]。治療組術(shù)前3 d開始給予ATRA 6 mg/(kg?d),溶于1 mL植物油中灌胃至處死,對照組、假手術(shù)組給予等量植物油灌胃。

頸動脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù)手術(shù)過程無菌操作。以25%烏拉坦(1 g/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉家兔后,沿頸前正中線剪開皮膚,游離右頸總動脈3～4 cm,近心端和遠(yuǎn)心端用動脈夾臨時夾閉,以4.5號頭皮針穿刺阻斷血管的兩端,用生理鹽水沖洗后向夾閉血管腔內(nèi)注射空氣,持續(xù)時間10 min。然后松開動脈夾壓迫止血,血流通暢后逐層縫合。術(shù)后每只大白兔每天肌內(nèi)注射青霉素 40萬 U,連續(xù)3 d。于術(shù)后第 7、14、28天分別處死A、B、C組動物,取病變部位血管等距切分4～5段,用10%中性緩沖甲醛溶液固定,石蠟包埋。血管標(biāo)本橫截面切片(4 μ m)。

1.3 血管形態(tài)學(xué)測定 切片行HE染色,顯微鏡下觀察血管結(jié)構(gòu),用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(IPP)進(jìn)行圖像分析,測定各個血管截面的內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(M A)、內(nèi)/中膜面積比率(I/M),取平均值。測量術(shù)后14、28 d處死兔頸動脈粥樣硬化病變最厚處內(nèi)彈力板至腔面垂直距離,作為該例動物的最大斑塊厚度。

1.4 免疫組化 用SP二步法進(jìn)行NF-κ B p65、P-選擇素免疫組化染色,一抗稀釋度均為1∶150,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,NF-κ B p65胞核及胞質(zhì)棕黃、棕褐色為陽性,P-選擇素胞膜棕黃、棕褐色為陽性。PBS代替一抗作陰性對照。用IPP進(jìn)行圖像分析,隨機(jī)測量每張切片6個高倍視野中陽性面積百分比及陽性染色的平均吸光度,各取平均值,用二者乘積再乘以100作為陽性表達(dá)指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以±s表示,組間用 t檢驗(yàn)及方差分析,組間比較用Student-Newman-Keuls法,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察 (1)假手術(shù)組各組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù),緊貼于內(nèi)彈力板;內(nèi)彈力板結(jié)構(gòu)完整,中膜層厚度均勻,平滑肌細(xì)胞呈環(huán)形排列,可見梭形胞核,排列方向一致。(2)對照組A組內(nèi)膜可見增生,為單層至數(shù)層細(xì)胞;內(nèi)彈力板多處斷裂,可見平滑肌細(xì)胞穿過內(nèi)彈力板,中膜層近內(nèi)彈力板處細(xì)胞外基質(zhì)增多,細(xì)胞排列紊亂。對照組B組內(nèi)膜增生較A組明顯加重,粥樣斑塊形成,平滑肌細(xì)胞聚積于內(nèi)皮下,尚可見炎癥細(xì)胞浸潤,以內(nèi)膜層為主;內(nèi)彈力板破壞更為嚴(yán)重,中膜細(xì)胞排列更加紊亂。對照組C組粥樣斑塊向管腔隆起,環(huán)形均勻性增厚和典型粥樣硬化偏心性狹窄均可見,內(nèi)膜層可見大量泡沫細(xì)胞并有脂質(zhì)池、脂質(zhì)核心形成,炎癥細(xì)胞浸潤更加嚴(yán)重;中膜亦有平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變。(3)治療組各組與對照組相比,其內(nèi)膜增厚程度、平滑肌細(xì)胞增生移行程度、內(nèi)彈力板破壞程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度及細(xì)胞泡沫化程度均較輕。各組IA、MA、I/M見表1。

2.2 粥樣斑塊厚度測定 治療組B組最大斑塊厚度為(0.08±0.02)mm,小于對照組 B組的(0.13±0.03)mm(t=3.397,P＜0.05)。對照組 C組[(0.21±0.05)mm]與治療組C組[(0.15±0.03)mm]最大斑塊厚度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.521,P＜0.05)。

2.3 免疫組化結(jié)果

2.3.1 NF-κ B p65的表達(dá) 假手術(shù)組各組內(nèi)皮層及中膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見微量NF-κ B p65表達(dá)。對照組A組中膜及內(nèi)膜層細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)可見NF-κ B p65多量表達(dá),以新生內(nèi)膜為主。對照組B、C組 NF-κ B p65表達(dá)量增加,泡沫細(xì)胞亦有表達(dá)。治療組NF-κ B p65表達(dá)規(guī)律與對照組相同,但陽性表達(dá)指數(shù)低于對照組(表 2、插頁Ⅰ圖1)。

表1 各組IA、MA及I/M值比較(±s)

表1 各組IA、MA及I/M值比較(±s)

*:P＜0.05,與對照組 A組比較;△:P＜0.05,與對照組比較;-:表示無此項(xiàng)。

組別 n IA(mm2) M A(mm2) I/M假手術(shù)組A組 6 - 0.33±0.03 -B組 5 - 0.33±0.03 -C組 6 - 0.33±0.05 -對照組A 組 6 0.07±0.01 0.36±0.05 0.21±0.05 B組 6 0.22±0.05 0.34±0.04 0.64±0.15 C組 6 0.33±0.05 0.34±0.04 0.97±0.08治療組成A 組 6 0.06±0.01* 0.33±0.04* 0.19±0.04*B組 6 0.13±0.02△ 0.33±0.04 0.39±0.09△C組 6 0.19±0.02△ 0.34±0.03 0.58±0.13△

2.3.2 P-選擇素的表達(dá) 假手術(shù)組各組內(nèi)皮層可見微量P-選擇素表達(dá)。對照組A組內(nèi)膜層及中膜層細(xì)胞膜可見P-選擇素大量表達(dá),內(nèi)皮表面和移行的平滑肌細(xì)胞及浸潤的炎癥細(xì)胞膜表達(dá)更加明顯。對照組B、C組P-選擇素持續(xù)高表達(dá),中膜平滑肌細(xì)胞、移行平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、泡沫細(xì)胞均可見其表達(dá)。治療組P-選擇素表達(dá)規(guī)律與對照組相同,但陽性表達(dá)指數(shù)低于對照組(表 2、插頁Ⅰ圖2)。

表2 ATRA對兔頸動脈 NF-κ B、P-選擇素表達(dá)的影響(±s)

表2 ATRA對兔頸動脈 NF-κ B、P-選擇素表達(dá)的影響(±s)

◆:P＜0.05,與對照組 A組比較;▲:P＜0.05與對照組 B組比較;■:P＜0.05,與對照組C組比較。

組別 n NF-κ Bp65 P-選擇素對照組A 組 6 2.20±0.82 2.21±0.73 B組 6 4.52±1.11 4.24±0.70 C組 6 3.82±0.71 3.28±0.43治療組A 組 6 0.92±0.59◆ 1.13±0.40◆B組 6 2.39±0.45▲ 2.18±0.68▲C組 6 2.23±0.45■ 2.14±0.46■

2.3.3 相關(guān)性分析 P-選擇素表達(dá)水平與NF-κ B p65表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.832,P＜0.05)。

3 討 論

本研究應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合內(nèi)膜損傷法制作兔頸動脈粥樣硬化狹窄模型,模擬兔頸動脈粥樣硬化形成的損傷和脂肪浸潤學(xué)說,以及PTCA術(shù)后再狹窄形成損傷學(xué)說,結(jié)果顯示,對照組與治療組顯微鏡下可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,提示粥樣斑塊形成過程中炎癥可能起著重要作用,ATRA能夠減輕內(nèi)膜增厚程度、平滑肌細(xì)胞增生移行程度、內(nèi)彈力板破壞程度和炎癥細(xì)胞浸潤程度。ATRA能明顯抑制內(nèi)膜增厚。本研究結(jié)果還表明內(nèi)膜損傷后粥樣硬化性狹窄的形成主要?dú)w因于內(nèi)膜的增厚,而血管中膜增厚并不明顯。

有研究表明,炎癥反應(yīng)在再狹窄的整個過程中起著重要作用[2]。球囊損傷和支架置入引起的內(nèi)膜增生在病理生理機(jī)制上有所不同,支架置入術(shù)后炎癥反應(yīng)起著更為重要的作用[8]。NF-κ B信號通路與動脈粥樣硬化及再狹窄的關(guān)系越來越受到關(guān)注[9]。有研究證明,多種藥物是通過抑制 NF-κ B通路,影響炎性因子的表達(dá)發(fā)揮其抗粥樣硬化及再狹窄的作用[10-12]。P-選擇素是一種重要的黏附分子,它的表達(dá)受NF-κ B的調(diào)控。P-選擇素在血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、血管損傷后的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、再生內(nèi)皮細(xì)胞表面均有表達(dá)[13]。有研究表明,P-選擇素缺失小鼠血管損傷后新生內(nèi)膜增生明顯減少,證明P-選擇素在血管損傷反應(yīng)中起重要作用[14]。

本研究結(jié)果顯示,NF-κ B在正常血管即有少量表達(dá),但主要集中在胞質(zhì)。而對照組可見NF-κ B多量表達(dá),平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均可以檢測到 NF-κ B,而且胞質(zhì)、胞核均有表達(dá),胞核檢測到 NF-κ B提示NF-κ B處于激活狀態(tài)。P-選擇素在多種細(xì)胞胞膜上廣泛表達(dá)。但是本研究中P-選擇素在粥樣斑塊形成過程中持續(xù)表達(dá),與黏附分子主要參與動脈粥樣硬化及再狹窄的早期過程的觀點(diǎn)并不相符,提示P-選擇素在兔頸動脈粥樣硬化及再狹窄的進(jìn)展期同樣發(fā)揮著重要作用。治療組與對照組陽性表達(dá)指數(shù)比較結(jié)果表明ATRA能夠下調(diào)NF-κ B和P-選擇素的表達(dá)。直線相關(guān)分析結(jié)果表明,NF-κ B與P-選擇素的表達(dá)呈正相關(guān),說明ATRA對P-選擇素的抑制作用可能是通過下調(diào)NF-κ B的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。金紅芳等[15]研究發(fā)現(xiàn),AT RA能夠抑制 NF-κ B的激活和表達(dá),下調(diào) NF-κ B的靶基因的表達(dá),從而有效抑制炎癥。本研究結(jié)果與之相符。

綜上所述,ATRA通過抑制NF-κ B的激活和表達(dá),下調(diào)NF-κ B的靶基因P-選擇素的表達(dá),進(jìn)而抑制病灶中的炎癥過程,可能是抑制內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的機(jī)制之一。鑒于再狹窄過程炎癥機(jī)制涉及多種信號通路及促炎性細(xì)胞因子,故對于ATRA抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。

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