李 軍 王朝陽(yáng)

1廣東藥學(xué)院（廣東廣州510006）

2湖北中醫(yī)藥大學(xué)（湖北武漢430065）

急性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病，約占急性腦血管病的70%～80%，有較高的病死率和致殘率。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性腦損傷的經(jīng)典方劑，能夠降低患者的致殘率，提高生存質(zhì)量。為了研究其作用機(jī)理是否與促進(jìn)腦血管新生有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法建立急性腦缺血大鼠模型，選擇觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)急性腦缺血大鼠腦缺血區(qū)微血管密度（MVD）及腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表達(dá)的影響，從血管新生的角度探討該方抗腦缺血損傷的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠100只，體質(zhì)量 250～300g，雌雄各半，購(gòu)于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物以《醫(yī)林改錯(cuò)》所載補(bǔ)陽(yáng)還五湯的藥味和比例配制：黃芪 30g，當(dāng)歸尾 10g，桃仁 10g，紅花 6g，赤芍 10g，川芎 10g，地龍（研末）6g。中藥飲片購(gòu)自湖北省中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)鑒定符合2005年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。補(bǔ)陽(yáng)還五湯制備：加水500mL浸泡30min，武火煎煮沸騰后改用文火加熱30min，收取1次藥液，再加水500mL煎煮，方法同前，去藥渣后用濾紙過(guò)濾，將2次藥液混合加熱濃縮至1mL藥液（含生藥1.6g），置于4℃下冷藏備用。尼莫地平片購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)有限公司，規(guī)格20mg/片，批號(hào)080102，用無(wú)菌蒸餾水溶解為0.1mg/mL溶液。CD31兔源性多克隆抗體，VEGF和bFGF兔源性多克隆抗體，SABC免疫組化試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、甲酰胺、瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司；其他異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物造模按照文獻(xiàn)［1］方法復(fù)制急性腦缺血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛（1.0g/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)操作臺(tái)上，取頸正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈分叉部下方剪一小口，將一預(yù)先燒成圓頭的尼龍線(xiàn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到遇到輕微阻力為止，插入深度由分叉部計(jì)為（18.5±0.5）mm。固定尼龍線(xiàn)，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后即縫合。術(shù)后，腹腔注射青霉素10萬(wàn)U/只，2次/d，連續(xù)3d，預(yù)防感染。室溫保持在26～30℃，手術(shù)時(shí)使用加熱墊。術(shù)后將動(dòng)物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)，自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物于清醒后2h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1～3分者入組，若有死亡等不足，動(dòng)物隨機(jī)替補(bǔ)。

1.4 分組與給藥大鼠造模成功后隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和尼莫地平組各10只，另設(shè)假手術(shù)組，假手術(shù)組只打開(kāi)頸部皮膚，畢露頸部血管后不做其他任何處理即縫合。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組動(dòng)物于術(shù)后第4日起按4mL/kg灌服補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液，尼莫地平組灌胃給予尼莫地平溶液1mg/kg，每日1次，給藥7d。其他各組動(dòng)物均給予等體積無(wú)菌蒸餾水，自由飲食、活動(dòng)。

1.5 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分大鼠清醒后，觀察其行為學(xué)變化，神經(jīng)癥狀參照文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行5級(jí)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀，0分；輕度神經(jīng)功能損傷（動(dòng)物前爪不能完全前伸），1分；中度神經(jīng)功能損傷（動(dòng)物向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈），2分；嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷（動(dòng)物向癱瘓側(cè)傾倒），3分；不能自發(fā)行走或意識(shí)昏迷，4分。各組動(dòng)物在處死前2h進(jìn)行評(píng)分。

1.6 標(biāo)本處理給藥后第8日取材。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/100g），剪開(kāi)胸腔暴露心臟，用灌注針頭刺入大鼠心臟左心室，通過(guò)心臟灌注生理鹽水150mL，然后以4%多聚甲醛PBS緩沖液300mL灌注固定，灌流維持20min，灌注效果以動(dòng)物頭頸堅(jiān)硬如實(shí)木質(zhì)地為佳。此時(shí)，迅速斷頭取腦，可見(jiàn)腦組織色白如蠟。將腦組織置入4%多聚甲醛，PBS緩沖液36h，行外固定。按冠狀切面切成2mm厚腦片6片，取自頭向尾端的第4片，采用常規(guī)方法制成5μm厚的腦切片，切片分兩組備用。

1.7 免疫組化檢測(cè)免疫組化采用SABC法，DAB顯色。每只動(dòng)物取海馬部位切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選3個(gè)視野，用Olympus Micro Image 4.0圖像處理系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。MVD計(jì)數(shù)按Weidner等［3］方法進(jìn)行，凡染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片在同一皮層缺血區(qū)選擇10個(gè)視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算出每mm2面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD的影響見(jiàn)表1。尼莫地平組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組神經(jīng)功能評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.05），補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與尼莫地平組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MVD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組MVD顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與尼莫地平組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能和腦組織MVD比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。 下同。

MVD（血管數(shù)/mm2）假手術(shù)組 10 0 8.21±1.05模型組 10 2.04±0.45* 15.62±1.82補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 10 1.35±0.32* 24.35±2.16*△尼莫地平組 10 1.62±0.35* 18.20±1.55組 別 n 神經(jīng)功能評(píng)分（分）

2.2 對(duì)急性腦缺血大鼠腦組織VEGF和bFGF的影響見(jiàn)表2。VEGF在假手術(shù)組有少量表達(dá)，腦缺血后在缺血半球皮層、室旁區(qū)明顯增多；模型組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和尼莫地平組與模型組比較顯著升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與尼莫地平組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦組織bFGF陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在梗死灶周?chē)べ|(zhì)，梗死灶中心表達(dá)較少，假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)僅見(jiàn)bFGF少量表達(dá)，bFGF陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色；模型組缺血半球皮質(zhì)bFGF表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著升高（P＜0.05），補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組和尼莫地平組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 （個(gè)/mm2，±s）

表2 各組大鼠腦組織VEGF和bFGF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 （個(gè)/mm2，±s）

與模型組比較，**P＜0.01。

組 別 n VEGF陽(yáng)性細(xì)胞 bFGF陽(yáng)性細(xì)胞假手術(shù)組 10 10.64±1.25** 5.72±0.85*模型組 10 44.25±2.34 9.58±1.62補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 10 64.62±2.20* 12.65±1.26*△尼莫地平組 10 57.64±2.25* 10.20±0.98

3 討 論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，功能補(bǔ)氣活血通絡(luò)，主治中風(fēng)偏癱，口眼歪斜，言語(yǔ)謇澀，口角流涎等癥。補(bǔ)陽(yáng)還五湯一經(jīng)問(wèn)世，便因其療效顯著而得到廣泛應(yīng)用，備受后世醫(yī)家推崇。臨床上用于治療各種腦血管疾病，取得了令人矚目的效果［4］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)、降低血液黏滯性、抑制血小板聚集、溶解血栓、對(duì)抗腦缺血后腦組織損傷等多種途徑發(fā)揮臨床作用［5-6］。

腦缺血后由于腦組織缺血、缺氧引起缺血半暗區(qū)神經(jīng)元變性、壞死，而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損，因此，盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)對(duì)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要，而缺血半暗區(qū)血流的恢復(fù)有賴(lài)于側(cè)支循環(huán)的建立。血管新生是改善腦組織血流供應(yīng)的一種有效方法，對(duì)中風(fēng)患者的預(yù)后十分關(guān)鍵，是近年來(lái)中風(fēng)研究的熱點(diǎn)之一［7］。在血管新生的研究中，MVD是普遍采用的能夠較直觀和有效反映新生血管的數(shù)目和側(cè)支循環(huán)建立情況的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組的MVD比假手術(shù)組和模型組均有所增加，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯組具有促進(jìn)腦梗死大鼠腦組織缺血區(qū)新血管形成的作用。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子，參與了腦缺血后腦組織的病理修復(fù)過(guò)程。VEGF可以促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增生和轉(zhuǎn)移，它在血管生成的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要作用，是目前公認(rèn)的血管新生中最關(guān)鍵的因子［8］。bFGF是一種具有強(qiáng)烈促增殖作用的多肽生長(zhǎng)因子，在神經(jīng)元中含量最為豐富［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組可以增加大鼠腦組織VEGF和bFGF的表達(dá)，且動(dòng)物神經(jīng)功能癥狀得到改善，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可促進(jìn)急性腦缺血大鼠缺血區(qū)血管新生，增強(qiáng)腦組織VEGF和bFGF的表達(dá)，可能是其抗腦缺血的作用機(jī)制之一。

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