徐 暢 宮麗鴻 趙添成 杜玉潔

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（遼寧沈陽(yáng)110032）

2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（遼寧沈陽(yáng)110032）

活心湯為本文通信作者宮麗鴻主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方。具有抗凝、抗血栓促纖溶作用，用于治療和改善動(dòng)脈粥樣硬化，臨床療效良好?；钚臏杏卸辔端幦缛?，蜈蚣等都有息風(fēng)止痙的功效，而白術(shù)、半夏等都有燥濕化痰的功效。故活心湯能很好的體現(xiàn)搜風(fēng)祛痰之法。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察搜風(fēng)祛痰法對(duì)血管緊張素Ⅱ致體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVECs）iNOS mRNA及ET-1 mRNA表達(dá)的影響，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物活心湯組方：全蝎 15g，蜈蚣2條，地龍20g，陳皮15g，半夏15g，白術(shù)15g,水蛭15g。以上藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2g/mL中藥濃縮液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物健康新西蘭大耳白兔（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）清潔級(jí)，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0～2.5kg。

1.3 儀器及試劑高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3C15K，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Therom HERAce11150）；倒置顯微鏡（Olympus IX71 ）；PCR 儀（Biometra UnioⅡ型，德國(guó)）；紫外分光光度計(jì)（UV-3000，英國(guó)）；凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)（Chemi Imager 5500，美國(guó)）；AngⅡ（美國(guó) Sigma 公司）；胰蛋白酶（美國(guó) Gibco公司）；DMEM（美國(guó) Gibco公司）；PCR引物（北京華大基因公司合成）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

2 方 法

2.1 藥物血清制備將兔隨機(jī)分為4組，每組5只?；钚臏摺⒅?、低劑量組參照文獻(xiàn)［1］給予活心湯200mL灌胃，質(zhì)量濃度分別為9.0、4.5、2.25mL/kg?？瞻讓?duì)照組給等容積的蒸餾水。連續(xù)5d，每日2次，第5日灌胃后2h（灌藥前禁食12h,不禁水）頸動(dòng)脈放血，分離血清，56℃ 30min滅活，低溫干燥，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫R用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液配成10mg/mL的濃度，再用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌。

2.2 HUVECs培養(yǎng)及鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株原代（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)科提供），用含20%胎牛血清的DMEN/F12培養(yǎng)基在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合狀態(tài)，再用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。培養(yǎng)的HUVECs形態(tài)符合內(nèi)皮細(xì)胞特征，抗人Ⅷ因子抗體染色陽(yáng)性。將培養(yǎng)的第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組取藥物血清及AngⅡ進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（空白血清）、 AngⅡ組（0.5μmol/L）、低劑量中藥血清組（0.5μmol/L AngⅡ+0.225μmol/L中藥血清）、中劑量中藥血清組（0.5μmol/L AngⅡ+0.45μmol/L中藥血清）、 高劑量中藥血清組（0.5μmol/L AngⅡ+0.9μmol/L中藥血清）。用中藥血清事先孵育2h后再加入AngⅡ0.5μmol/L刺激2h，收集細(xì)胞。

2.4 RT-PCR法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA及ET-1mRNA 采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度并定量。根據(jù)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供的iNOS、ET-1及NF-κB和內(nèi)參照β-actin的mRNA序列，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物。序列見表1。反應(yīng)條件：94℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5min 后結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。取5μL PCR產(chǎn)物與2μL Lodding Buffer混合，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V 1.5h，電泳結(jié)束后，采用Flour Chem V 2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 活心湯對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響見圖1。正常對(duì)照組的iNOSmRNA表達(dá)最低，AngⅡ組的iNOS mRNA表達(dá)明顯高于其他4組（P＜0.05）。3個(gè)中藥血清組iNOS mRNA表達(dá)比AngⅡ組顯著降低（P＜0.05），各劑量中藥血清組相比，中、高劑量中藥血清組抑制iNOS mRNA表達(dá)更加明顯（P＜0.05），中、高劑量中藥血清組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOSmRNA表達(dá)

3.2 活心湯對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)的影響見圖2。正常對(duì)照組的ET-1 mRNA表達(dá)最低，AngⅡ組的ET-1 mRNA表達(dá)明顯高于其他4組（P＜0.05）。3個(gè)中藥血清組ET-1 mRNA表達(dá)比AngII組顯著降低（P＜0.05），與低劑量中藥血清組相比，中、高劑量中藥血清組抑制ET-1 mRNA表達(dá)更加明顯（P＜0.05），中、高劑量中藥血清組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖2 血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)

4 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈硬化的血管病中最重要的一種，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始。硬化發(fā)生在心血管，易引發(fā)心肌梗死、冠心病；發(fā)生在腦血管則引起腦卒中、腦血栓、腦出血等腦血管病。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、腫瘤壞死因子，血管生成因子及白細(xì)胞介素均為血管發(fā)生最主要的促血管源性調(diào)節(jié)器［2-4］。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的最為重要的生物活性物質(zhì)，它不僅是血管收縮因子，引起血流動(dòng)力學(xué)改變，更是生長(zhǎng)因子，在以組織器官進(jìn)行性纖維化為特征的慢性疾病的進(jìn)展中起十分重要的作用。有研究［5］發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能增加結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、mRNA及其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)組織膠原沉積。ET是1988年由日本學(xué)者Yanagisawa等從豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離和純化的一種21個(gè)氨基酸組成的多肽，有強(qiáng)大的收縮血管、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚、加速生長(zhǎng)因子、黏附分子等合成與釋放及其調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)等多種生物學(xué)作用［6］，是目前所知的最強(qiáng)血管收縮因子［7］。ET 由機(jī)體細(xì)胞E上自分泌或旁分泌形成分泌，在局部通過(guò)內(nèi)皮素受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可引起所有動(dòng)脈和靜脈收縮。ET-1與AngⅡ作為強(qiáng)有力的血管收縮因子，已被廣泛研究。近年來(lái)，人們通過(guò)大量體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ET-1與AngⅡ還具有促細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)蓄積及炎性介質(zhì)釋放等作用［8-9］。

動(dòng)脈粥樣硬化的主要病機(jī)為痰濁血瘀，痰濁能使LDL升高，AngⅡ可以使血管收縮引起血瘀。而中醫(yī)有津血同源理論，且津停為痰，又認(rèn)為久病入絡(luò)，宜搜風(fēng)通絡(luò)祛痰，治血與治風(fēng)相通，從痰從風(fēng)論治。本實(shí)驗(yàn)所用中藥湯劑活心湯是本文通信作者多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，其中全蝎，具息風(fēng)鎮(zhèn)痙，攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛之功用，藥理研究表明，其有抗凝、抗血栓促纖溶作用［11］；蜈蚣具有息風(fēng)止痙、解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗心肌缺血、加強(qiáng)心肌收縮力和擴(kuò)血管的作用［12-13］；地龍有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿等作用，其藥理作用有解熱鎮(zhèn)靜，抗血栓，降壓等［14］；水蛭具有破血，逐瘀，通經(jīng)，消腫的功效，可改善心腦缺氧狀況，降低血流黏稠度及調(diào)脂［15］。上述諸藥均有活血化瘀、息風(fēng)通絡(luò)的功效，共為君藥可謂要中病機(jī)。與陳皮、半夏、白術(shù)合用，既能燥濕化痰，又可寬胸理氣，消痞散結(jié)，為臣藥。其中陳皮能抑制血小板聚集，調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動(dòng)脈硬化［16-17］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾為生痰之源，痰濕可致血行不暢，痰瘀互結(jié)，導(dǎo)致血脂升高。諸藥合用，能夠更好的起到防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本實(shí)驗(yàn)用AngⅡ刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后觀察到ET-1 mRNA及iNOS mRNA的表達(dá)明顯升高，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统闪?。通過(guò)不同劑量中藥血清作用于AngⅡ刺激后的血管內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)ET-1 mRNA及iNOS mRNA的表達(dá)都有下降，中高劑量下降明顯，證明中藥搜風(fēng)祛痰法對(duì)ET-1 mRNA及iNOS mRNA表達(dá)有抑制作用，進(jìn)而改善了內(nèi)皮功能，延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。

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