杜艷軍 孫國杰 孔立紅

湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院（湖北武漢430061）

近年來，越來越多的臨床資料表明血腫擴大及其繼發(fā)性腦損害是導(dǎo)致腦出血病情加重甚至死亡的主要原因，腦血管的舒縮功能則直接影響腦出血后血液的循環(huán)與調(diào)節(jié)。目前關(guān)于神經(jīng)肽Y（NPY）在腦血管內(nèi)皮細胞的作用研究較少。本實驗將采用免疫組化方法，觀察NPY在大腦皮層神經(jīng)細胞和內(nèi)皮細胞中的表達，初步探討電針水溝對腦出血大鼠腦血管神經(jīng)調(diào)節(jié)的動態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1 材料健康青年wistar大鼠80只，體質(zhì)量200～250g，雌雄各半，湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心提供。SABC試劑盒和兔抗大鼠NPY單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 腦出血模型復(fù)制將wistar大鼠隨機分為8組：正常組、假手術(shù)組、模型 3、24、72h 組、電針 3、24、72h 組，每組各 10 只。 采用膠原酶Ⅶ誘發(fā)的大鼠尾殼核出血模型［1］。動物經(jīng)6%水合氯醛腹腔麻醉（400mg/kg），頭頂備皮后將動物固定于腦立體定位儀（WDT-Ⅱ微電極推進器腦立體定位儀，國營西北光學(xué)儀器廠）上，正中矢狀切開頭皮，剝離骨膜，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使動物的前、后囟處于同一水平。以前囟為坐標原點，向后1.0mm，向右4.0mm，確定注射點坐標，用手動微型鉆（直徑1.0mm）在注射點鉆透顱骨。用1μL的微量注射器吸取0.8μL的膠原酶Ⅶ溶液（Sigma 0.5U/μL），緩慢進針 5.0mm，緩慢注射后留針 2min，緩慢退針，鉆孔處填入明膠海綿止血?？p合皮膚，腹腔注射氨芐青霉素8萬U，動物清醒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 針刺方法按照常用動物穴位定位法取大鼠水溝穴，用26號、1寸不銹鋼毫針針刺，接G6805－II電針治療儀（空白電極接大鼠耳朵），連續(xù)波，頻率120次/min，強度1mA，留針30min。在造模大鼠麻醉清醒后立即針刺1次，每隔24h再針刺1次。

1.4 Bederson神經(jīng)體征評分法0級：無任何行為異常，無缺損體征。1級：左前肢屈曲。2級：無旋轉(zhuǎn)運動，但對來自右側(cè)推力的抵抗力減弱。3級：對來自右側(cè)推力的抵抗力減弱的同時，出現(xiàn)向左側(cè)的旋轉(zhuǎn)運動。

1.5 免疫組織化學(xué)染色將各組大鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉，開胸經(jīng)升主動脈依次灌入生理鹽水100mL、4℃預(yù)冷的含4%多聚甲醛的0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）400mL。灌畢取腦，取視交叉至乳頭體之間上至皮層長約5mm的腦組織，置于4%多聚甲醛溶液過夜后固定，石蠟包埋切片，片厚5μm。按免疫組化SABC法常規(guī)步驟操作。每只動物隨機選取2張非連續(xù)切片，每張切片在出血側(cè)大腦皮層隨機采集3個視野。光鏡下檢測。以胞質(zhì)染成棕色為陽性結(jié)果，用HPIAS-1000高清晰度圖像分析儀（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院千屏影像公司產(chǎn)）對各組陽性細胞進行吸光度分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，組間樣本均數(shù)差異比較選單因素方差分析，組間比較用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電針對尾殼核出血大鼠神經(jīng)缺損行為體征的治療作用

見表1。造模大鼠麻醉醒后模型組與電針組的神經(jīng)缺損體征綜合評分無明顯差異（P＞0.05），且電針組的神經(jīng)缺損體征略高于模型組。電針組大鼠神經(jīng)缺損體征綜合評分逐時遞減，3、24、72h時均與模型組比較有顯著差異（P<0.05或0.01）。

表1 模型組與電針組不同時間點神經(jīng)缺損體征評分比較 （分，±s）

表1 模型組與電針組不同時間點神經(jīng)缺損體征評分比較 （分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 造模醒后 3h 24h 72h模型組 30 2.90±0.03 2.90±0.03* 2.77±0.04** 2.70±0.06**電針組 30 2.93±0.02 2.57±0.07* 1.67±0.09** 1.03±0.03**

2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)NPY免疫陽性細胞的表達見表2、表3、圖1。正常組與假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞有少量的NPY陽性表達；腦出血后3h大鼠大腦皮質(zhì)NPY的陽性表達開始增高，24h呈最高峰，胞漿和突起濃染呈棕褐色，血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)中有棕色顆粒，72h時有所下降，與正常組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。電針組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞的NPY陽性表達，也于3h開始表達，于24h表達較高，72h表達減弱，與模型組及正常組比較均有顯著差異（P<0.05或 0.01）。

表2 各組大鼠不同時間點大腦皮質(zhì)NPY陽性反應(yīng)平均光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點大腦皮質(zhì)NPY陽性反應(yīng)平均光密度值比較（±s）

與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 3h 24h 72h正常組 10 0.1135±0.0413假手術(shù)組 10 0.1066±0.0314模型組 10 0.2603±0.0367△△ 0.3901±0.0634△△ 0.2094±0.0442△△電針組 10 0.1708±0.0412**△△ 0.1680±0.0421**△△ 0.1649±0.0535**△△

表3 各組大鼠不同時間點大腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮細胞NPY陽性細胞率比較 （%，±s）

表3 各組大鼠不同時間點大腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮細胞NPY陽性細胞率比較 （%，±s）

組別 n 3h 24h 72h正常組 10 11.24±1.18假手術(shù)組 10 12.86±1.06模型組 10 21.19±3.11△△ 33.65±4.27△△ 19.41±2.38△△電針組 10 14.97±2.23**△ 15.44±2.23**△ 14.69±2.42**△

3 討 論

腦出血是發(fā)病率、死亡率及致殘率都很高的急性腦血管疾病。近幾年隨著CT、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）和彌散加權(quán)成像（DWI）的運用，血腫擴大和缺血半暗帶再次成為腦出血病理研究的熱點［2］，認為腦出血后血腫擴大和局部腦血流（rCBF）下降造成缺血、缺氧是早期神經(jīng)功能惡化的重要原因之一。Warach［3］更結(jié)合患者的神經(jīng)功能惡化和轉(zhuǎn)歸進行細致的研究分析后，認為rCBF下降者發(fā)生神經(jīng)功能惡化和預(yù)后不良的概率遠高于rCBF無變化者。因而腦血管調(diào)節(jié)機制在腦出血后腦循環(huán)發(fā)生一系列改變中具有重要作用。

NPY是腦內(nèi)含量最高的發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)和血管調(diào)節(jié)活性作用的多肽［4-5］，具有強烈收縮腦血管和降低腦血流的效應(yīng)。主要分布在大腦皮質(zhì)、丘腦和腦干。向大鼠頸內(nèi)動脈注射NPY可使腦血流下降40%～98%［6］；臨床發(fā)現(xiàn)腦出血患者血漿NPY濃度顯著升高，且隨病情好轉(zhuǎn)而降低［7］。目前認為NPY的增高勢必引起血管收縮，進一步升高血壓，持續(xù)出血及擴大血腫，并加重周圍組織缺血缺氧［8］。

圖1 各組大腦皮層的NPY陽性神經(jīng)元表達（×200）

前期我們觀察了針刺水溝對急性不完全腦缺血大鼠腦底動脈NPY的密度影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦血管的NPY能神經(jīng)參與了針刺水溝增加腦血流的效應(yīng)。本實驗顯示正常組與假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元有少量的NPY陽性表達；腦出血后3h大鼠大腦皮質(zhì)NPY的陽性表達開始增高，24h達最高峰，胞漿和突起濃染呈棕褐色，血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)中有棕色顆粒，72h時有所下降，但依然可見細胞軸突與纖維呈棕褐色，與正常組比較均有顯著差異。電針水溝則能有效抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)元NPY的增強，此與電針能降低凝血酶的活性、抑制炎性反應(yīng)及改善血液流變性等機制有關(guān)。

本實驗同時發(fā)現(xiàn)腦出血的大鼠內(nèi)皮細胞也有NPY的陽性表達，且伴隨時間而發(fā)生變化。目前關(guān)于腦血管內(nèi)皮細胞介導(dǎo)NPY作用的研究較少。Bao L等［9］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞上存在較多的NPY1受體。認為NPY可通過對內(nèi)皮細胞的作用，產(chǎn)生血管活性物質(zhì)［10］，增強或減弱其他遞質(zhì)對血管的刺激作用，從而影響血管的生成［11］及腦血流。更有學(xué)者認為NPY通過減少細胞內(nèi)cAMP的含量，以調(diào)整內(nèi)皮細胞對大分子滲透性，而具有內(nèi)皮屏障功能［12］。實驗通過電針水溝可降低腦出血后3h血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)的NPY表達，但并未隨著時間呈現(xiàn)明顯的降低趨勢，3、24、72h時間段內(nèi)皮細胞NPY的表達無顯著差異，其具體機制尚不清楚。

綜上表明，腦出血后NPY對腦血管的調(diào)節(jié)作用是多方面的。NPY的收縮血管功能與NPY對血管內(nèi)皮細胞的作用效應(yīng)之間是何關(guān)系，腦出血后不同時間段NPY對血管內(nèi)皮細胞的作用效應(yīng)是否存在不同，是今后值得進一步研究的問題。

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