王律韻 楊潔紅 張宇燕 萬海同 李金輝

浙江中醫(yī)藥大學(xué)（浙江杭州310053）

附子與甘草配伍在中藥配伍中的應(yīng)用有一定的代表性，是臨床常用的藥對。附子與甘草配伍能減毒增效已經(jīng)為人們所認(rèn)識，但兩者配伍減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)未能進(jìn)一步闡明。本實驗通過研究附子與甘草主要活性部位組合后毒性、強(qiáng)心效應(yīng)的改變，

探討中醫(yī)用藥的配伍規(guī)律，闡明附子與甘草配伍產(chǎn)生減毒增效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，探討附子等有毒中藥減毒增效的合理性與規(guī)律性，同時突破以往研究單味藥或單一化學(xué)成分的局限，并為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供方法和思路，為臨床上安全、高效的應(yīng)用有毒中藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥AG135電子天平（瑞士，梅特勒-托利多儀器有限公司）；DJW-2電動記紋鼓（上海聯(lián)德科教儀器設(shè)備有限公司）。附子、甘草藥材：購自浙江臨安市醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)鑒定分別為毛茛科烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品（批號 20091115）、豆科甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖（批號20080925）；附子生物堿、甘草有效部位由本研究所前期實驗提取、制備及純化 （附子生物堿有效部位含生物堿0.63%；甘草有效部位含甘草三萜78.40%，甘草黃酮17.51%）。附子生物堿與甘草有效部位（甘草三萜和黃酮部位）配伍液以生藥1∶1折算，實驗前分別用生理鹽水配制相應(yīng)的質(zhì)量濃度。任氏液：20%氯化鈉 32.5mL，10%氯化鉀 1.4mL，10%氯化鈣 1.2mL，5%碳酸氫鈉4.0mL，1%磷酸二氫鈉1.0mL，葡萄糖2g，加蒸餾水至1000mL。低鈣任氏液：所含氯化鈣量為任氏液的1/4，其他成分不變，加蒸餾水至1000mL。

1.2 實驗動物ICR小鼠200只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g；蟾蜍，120 只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心供應(yīng)。

1.3 附子生物堿與甘草有效部位配伍的急性毒性實驗將200只小鼠實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗前禁食不禁水12h，隨機(jī)分20組，每組各10只，雌雄各半，1～5組口服（灌胃）給予附子有效部位（生物堿部位），6～10組口服給予附子生物堿與甘草有效部位配伍液；11～15組腹腔給予附子有效部位 （生物堿部位），16～20組腹腔給予附子生物堿與甘草有效部位配伍液。觀察小鼠毒性反應(yīng)，采用孫氏綜合法（改進(jìn)寇氏法）［1］計算其半數(shù)致死量（LD50）。

1.4 附子生物堿和甘草有效部位組合的強(qiáng)心實驗

1.4.1 最小有效質(zhì)量濃度和最低中毒質(zhì)量濃度的確定 蟾蜍搗毀大腦、脊髓，仰位固定，暴露心臟，將盛有任氏液的蛙心套管插入心臟 “V”形切口，剪斷，用任氏液沖洗至無色，將離體蛙心與傳感器連接，記錄曲線。離體蛙心內(nèi)滴入任氏液后，能在體外正常跳動，保持穩(wěn)定，當(dāng)?shù)稳氲外}任氏液后，產(chǎn)生心臟舒縮無力。取56只蟾蜍，每組8只，待心臟活動恒定后，用吸管吸去管內(nèi)液體， 分別加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL 的附子生物堿液觀察心臟活動情況。將心臟收縮幅度增加5%以上的質(zhì)量濃度作為其最小有效質(zhì)量濃度；將開始產(chǎn)生抑制作用，心肌收縮力減弱等癥狀的質(zhì)量濃度作為最低中毒質(zhì)量濃度。

1.4.2 附子生物堿和甘草有效部位配伍對心臟毒性的作用 分別取8只蟾蜍，分別以附子生物堿不同中毒質(zhì)量濃度與甘草活性物質(zhì)配伍（按生藥1∶1折算），觀察對離體蛙心的毒性作用。

1.4.3 附子生物堿和甘草有效部位配伍前后強(qiáng)心作用的比較取48只蟾蜍分成4組，2組待心臟活動恒定后，用吸管吸去管內(nèi)液體，分別加入附子生物堿液（最小有效質(zhì)量濃度）、附子生物堿和甘草有效部位配伍液；2組待心臟活動恒定后，用吸管吸去管內(nèi)任氏液，再緩慢滴入低鈣任氏液，待作用明顯并穩(wěn)定后，再吸去管內(nèi)液體，分別加入附子生物堿液（最小有效質(zhì)量濃度）、附子生物堿和甘草有效部位配伍液。觀察附子生物堿最低有效質(zhì)量濃度液與甘草有效部位配伍液前后對正常離體心臟和收縮無力的離體心臟的強(qiáng)心效果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用Kruskal-Wallis H檢驗 （秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 附子生物堿與甘草有效部位配伍的急性毒性實驗小鼠給予附子生物堿部位后，癥狀表現(xiàn)明顯，小鼠活動減少，并引起惡心、嘔吐、痙攣、僵直、步行障礙、腹瀉等，嚴(yán)重的30min內(nèi)死亡；給藥后12～24h后小鼠逐漸喝水、進(jìn)食。死亡動物經(jīng)尸檢，肉眼未見明顯病理改變（附子生物堿的毒性主要為心臟的毒性，表現(xiàn)為通過抑制呼吸及引起心律紊亂等而導(dǎo)致死亡，因此本實驗觀察死亡動物肉眼未見明顯臟器等病理改變）。存活動物上述癥狀消失后，逐漸恢復(fù)正常，給藥后7d體質(zhì)量均略有增長。附子生物堿與甘草有效部位配伍前后不同給藥途徑的LD50測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：口服附子生物堿與甘草有效部位（甘草三萜和黃酮部位）配伍后的LD50明顯比單服附子生物堿高；腹腔注射給予附子生物堿后LD50降低，而與甘草有效部位（甘草三萜和黃酮部位）配伍后，其相應(yīng)也升高 。實驗表明，附子生物堿部位與甘草有效部位（甘草三萜和黃酮部位）配伍可明顯減小附子生物堿的毒性。

表1 附子生物堿與甘草有效部位配伍前后LD50比較

2.2 附子生物堿和甘草活性部位組合的強(qiáng)心實驗研究

2.2.1 附子生物堿液最小有效質(zhì)量濃度和最低中毒質(zhì)量濃度的確定 當(dāng)正常心臟按梯度加入不同質(zhì)量濃度的附子生物堿液，質(zhì)量濃度為0.30mg/mL時能產(chǎn)生明顯的強(qiáng)心作用，收縮幅度增加5%以上，作為其最小有效質(zhì)量濃度；質(zhì)量濃度為0.6mg/mL時開始產(chǎn)生抑制作用，心肌收縮力減弱等，將此質(zhì)量濃度作為最低中毒質(zhì)量濃度；而給予0.7mg/mL的附子生物堿液后，心臟產(chǎn)生心律紊亂，甚至停止搏動。

2.2.2 附子生物堿和甘草有效部位配伍對心臟毒性的作用 正常心臟中加入附子生物堿最低中毒質(zhì)量濃度0.6mg/mL與甘草活性物質(zhì)2.8mg/mL配伍后，對離體心臟強(qiáng)心作用明顯，但未出現(xiàn)心臟抑制及死亡等情況；附子生物堿0.7mg/mL與甘草有效部位3.3mg/mL配伍后，對離體心臟產(chǎn)生強(qiáng)心作用，約10min后出現(xiàn)抑制，有輕微心肌收縮力減弱，心律紊亂，未見心臟停止搏動。實驗表明附子生物堿和甘草有效部位配伍后能使附子生物堿保持對離體心臟的強(qiáng)心作用而降低對其毒性。

2.2.3 附子生物堿和甘草有效部位配伍前后強(qiáng)心作用的比較 正常離體心臟和收縮無力的離體心臟中分別加入附子生物堿最低有效質(zhì)量濃度液與附子生物堿最低有效質(zhì)量濃度和甘草有效部位配伍液，表現(xiàn)出不同的強(qiáng)心效果。由表2可知，對離體蛙心，附子生物堿、附子生物堿和甘草有效部位配伍均有較強(qiáng)的強(qiáng)心作用，在低鈣狀態(tài)下表現(xiàn)更強(qiáng)。對正常心臟與舒縮無力心臟，附子生物堿和甘草有效部位配伍的強(qiáng)心作用均比單用附子生物堿強(qiáng)，表明附子生物堿和甘草有效部位配伍能增強(qiáng)附子生物堿的強(qiáng)心作用。

表2 附子生物堿與甘草有效部位配伍對離體蛙心的強(qiáng)心作用比較（n）

3 討 論

中醫(yī)配伍用藥的實質(zhì)在于“組分合和”，即通過組分在數(shù)量上產(chǎn)生變化，起到功效上相同或不同，或是產(chǎn)生新的組分，起到增（減）效減（增）毒作用；再者是各組分通過多層次，多途徑、多靶點之協(xié)同整合，起到增（減）效減（增）毒作用。甘草對附子的減毒機(jī)理主要為甘草中甘草酸、甘草次酸和甘草苷等黃酮類與附子生物堿等毒性成分的結(jié)合或轉(zhuǎn)化，使其轉(zhuǎn)化為毒性較小或無毒性的物質(zhì)。也可能通過各組分對不同靶點的作用，使其相互作用增強(qiáng)或抵消-多靶點整合作用。有研究表明［2］，甘草與附子合煎時可顯著降低附子毒性成分烏頭堿的溶出率，并呈高度負(fù)相關(guān)。楊明等［3］認(rèn)為甘草與附子合煎時，甘草中的酸性物質(zhì)與附子中的酯型生物堿產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，可能為甘草降低附子毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。附子生物堿、甘草三萜皂苷和甘草黃酮等分別為附子、甘草的主要活性物質(zhì)。急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)附子生物堿與甘草有效部位組合后小鼠的半數(shù)致死量明顯增加，即可明顯減小附子生物堿部位的毒性。離體蛙心實驗中，附子具有較強(qiáng)的強(qiáng)心、正性肌力作用，而質(zhì)量濃度增加會產(chǎn)生明顯的心臟毒性，甚至導(dǎo)致心臟停止搏動，而與甘草有效部位配伍后其強(qiáng)心作用增強(qiáng)，毒性作用顯著降低。

甘草對附子的減毒作用還表現(xiàn)在體內(nèi)藥理作用的拮抗。其物質(zhì)基礎(chǔ)可能為甘草黃酮［4］。甘草中黃酮類化合物對于附子中的烏頭堿誘發(fā)的心律失常有很好的拮抗作用。有研究表明［5］，甘草總黃酮能延長烏頭堿誘發(fā)的小鼠心律失常的潛伏期，減少氯仿誘發(fā)的小鼠心室纖顫陽性率，增加哇巴因誘發(fā)豚鼠出現(xiàn)室性早博、室顫和心博停止所用劑量。進(jìn)一步研究表明［6］，甘草類黃酮和異甘草素能使烏頭堿誘發(fā)的動物心律失常的持續(xù)時間明顯減少，表明其有抗烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常作用。本實驗表明，附子生物堿有明顯的強(qiáng)心作用，對收縮無力心臟更明顯，但其同時有較強(qiáng)的毒性，引起心肌收縮力減弱，心律紊亂，最后心臟停止搏動等毒性癥狀；附子生物堿與甘草有效部位（甘草三萜和黃酮）配伍后，其毒性明顯減弱。甘草有效部位（甘草三萜和黃酮）在實驗中表現(xiàn)兩方面功效，一方面可以減弱由于附子生物堿誘發(fā)的心律失常，減小附子生物堿對離體蛙心的毒性，另一方面可以持續(xù)附子生物堿的強(qiáng)心作用，且作用明顯。

附子與甘草配伍能減毒增效，其重要的物質(zhì)基礎(chǔ)是以烏頭堿為代表的附子生物堿、以甘草酸和甘草苷為代表的甘草三萜皂苷和甘草黃酮，即甘草有效部位。附子生物堿與甘草有效部位（甘草三萜皂苷和甘草黃酮）組合能減小對小鼠和離體蛙心的毒性，同時相應(yīng)增強(qiáng)強(qiáng)心的效果。

［1］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：112.

［2］陳建萍，譚炳炎，吳偉康，等.四逆湯中附子甘草配合規(guī)律研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2001，7（3）：15.

［3］楊明，劉小彬，黃慶德.附子甘草配伍解毒增效機(jī)理探析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2003，14（4）：197.

［4］郭盛，唐于平，宿樹蘭，等.近10年來中藥配伍減毒的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（10）：74.

［5］胡小鷹，彭國平，陳汝炎.甘草總黃酮抗心律失常研究［J］.中草藥，1996，27（12）：733.

［6］胡小鷹，彭國平，陳汝炎.甘草拮抗附子心律失常毒性的機(jī)理研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1996，12（5）：23.