楊青平，俞發(fā)榮，車紅霞，張梅，胡瑞萍，王擒虎，石磊

2型糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，約占糖尿病群體總數(shù)的95%，已成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。糖尿病及其并發(fā)癥不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時也是致殘、致死的重要原因。因此，建立合適的2型糖尿病模型，對于篩選預(yù)防和治療糖尿病的有效藥物，研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病、治療、預(yù)防和轉(zhuǎn)歸有重要意義。據(jù)報道[1-5]，植物中二苯乙烯類化合物具有明顯的降糖作用。對人工合成的二苯乙烯的降糖作用研究尚未見報道。本研究采用給予脂肪乳和鏈脲佐菌素的方法建立2型糖尿病大鼠模型，研究人工合成的二苯乙烯降血糖作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性健康Wistar大鼠50只，體重220～230 g，購于甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(動物質(zhì)量合格證號：醫(yī)動字14-008)；二苯乙烯，分子量：130.19，淺黃色透明液體，LD50：小鼠經(jīng)口1225 mg/kg，購于英國Alfa Aesar公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購于SIGMA公司；鹽酸二甲雙胍(metformin)緩釋片，購于天津市津蘭藥業(yè)有限公司，實驗時研末，用蒸餾水配制成所需濃度；脂肪乳，自制(豬油20%，蔗糖20%，食鹽2%，膽固醇2%，谷氨酸鈉1%，膽酸納1%，甲巰咪唑1%，丙二醇30 ml，加雙蒸水至100 ml)；全自動生化分析儀(日立7600，日本株式會社生產(chǎn))；分光光度計(721B型，南京金牛高速分析儀器有限公司)。全部實驗均在甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點實驗室(甘肅政法學(xué)院，SPF級實驗室，使用許可證號：SYXK(甘)2010-0002)完成。

1.2 2 型糖尿病模型的建立 50只Wistar雄性大鼠隨機分為模型組(n=40)和對照組(n=10)。全部大鼠在SPF級實驗室IVC飼育盒飼養(yǎng)，自由飲食進水，明暗周期12 h，單籠飼養(yǎng)。動物房溫度20℃～23℃，濕度55%～65%，適應(yīng)7 d。模型組口服脂肪乳20 ml/kg；對照組灌胃給予等量蒸餾水。每天1次，連續(xù)40 d。分別在第41、42天時模型組大鼠腹腔注射STZ 120 mg/kg、100 mg/kg，各1次。48 d后禁食12 h，不禁水，尾部采血，測空腹血糖和血脂值。

1.3 實驗分組 模型組大鼠根據(jù)血脂、血糖值隨機分為：①A組(n=10)：灌胃二苯乙烯500 mg/kg；②B組(n=10)：灌胃二苯乙烯200 mg/kg；③C組(n=10)：灌胃二苯乙烯100 mg/kg；④D組(n=10)：灌胃二甲雙胍100 mg/kg。對照組(E組)灌胃等量蒸餾水。各組每天給藥1次，連續(xù)給藥20 d。

1.4 血糖和血脂水平的測定 所有大鼠給藥后第21天，禁食12 h，不禁水，從尾靜脈采血，用日立7600全自動生化分析儀檢測空腹血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平。

1.5 大鼠肝糖元含量的測定

1.5.1 標準曲線的制作 分別取100 mg/L的葡萄糖溶液 0.05 ml、 0.1 ml、 0.2 ml、 0.3 ml、 0.4 ml、 0.6 ml、0.8 ml，用蒸餾水補足1 ml，將試管置于冰水浴中，再加入4 ml蒽酮試劑，加完后放入沸水煮沸10 min，立即取出迅速沖冷，室溫平衡10 min，721B型分光光度計在620 nm下測定吸光度A值，繪成標準曲線。

1.5.2 肝臟糖元含量的測定 稱取肝臟500 mg，加5%的三氯乙酸液4 ml制成勻漿，3000 r/min離心5 min，取上清液1 ml加入4 ml蒽酮試劑，其余步驟同1.5.1項。用回歸方程計算樣品肝糖元含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中Dunnett單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 2 型糖尿病模型的建立 給予脂肪乳和腹腔注射STZ后，模型組大鼠的Glu和TG、TC、LDL-C、HDL-C分別升高140.89%、25.77%、275.52%、105.54%和31.25%，與建模前比，差異具有顯著性意義(P＜0.01)，建模成功。見圖1。

圖1 建模前后大鼠血糖和血脂水平

2.2 二苯乙烯對模型大鼠肝糖元水平的影響 以葡萄糖溶液濃度及其吸光度A值作標準曲線，見圖2。

圖2 葡萄糖吸光度標準曲線

表1 二苯乙烯對大鼠血糖和血脂水平的影響

按標準曲線方程y=0.005x2+0.0061x+0.0179計算出每g肝組織糖元水平。給藥20 d后，A、B、C肝糖元水平比E組提高了8.06%～16.17%，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。結(jié)果提示，二苯乙烯能促進肝臟合成肝糖元，從而降低血糖水平。而D組肝糖元水平明顯低于A、B、C組，略低于E組水平，提示，二甲雙胍降糖途徑可能與肝糖元合成關(guān)系不大。見表1。

2.3 二苯乙烯對血糖、血脂的調(diào)節(jié)作用 給藥后，模型組血糖和血脂水平比給藥前明顯降低(P＜0.05～0.01)。見表1。

3 討論

2型糖尿病的特點是以胰島素抵抗伴胰島素分泌相對不足為主要病理生理過程[6]。胰島素抵抗是指機體靶組織對胰島素的反應(yīng)性低于正常的一種病理生理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為肝臟及其外周組織(肌肉、脂肪組織)對葡萄糖的攝取障礙及肝臟葡萄糖輸出增多，肝臟對葡萄糖攝取和利用均降低。肝臟糖的產(chǎn)生及肝糖輸出亦增加，血液中的葡萄糖無法正常進入組織細胞被利用，因而使血糖升高最終導(dǎo)致糖尿病。

目前，很多學(xué)者采用不同的方法建立了糖尿病實驗動物模型[7-9]，陳秋等曾模仿機體胰島素耐受的發(fā)病機制及其病理學(xué)特點，用生理及超生理濃度的胰島素分別刺激HepG2細胞，采用高濃度胰島素體外誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立與復(fù)制了一種呈胰島素耐受特點的HepG2細胞模型[10]。利用胰島素抵抗動物模型和細胞模型進行了大量的藥物有效成份篩選[11-14]。由于2型糖尿病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，因此近年的研究中重視了飲食的重要性，尤其是高脂、高熱量的不合理的飲食結(jié)構(gòu)對代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展起著推動作用。

本文采用脂肪乳和分次腹腔注射STZ后，大鼠的Glu和TG、TC、LDL-C、HDL-C分別升高140.89%、25.77%、275.52%、105.54%和31.25%，與建模前比，差異具有顯著性意義(P＜0.01)，建立的2型糖尿病模型表現(xiàn)出肥胖、高血糖伴有高血脂血癥及胰島素抵抗，與2型糖尿病的特征一致[15]。給予二苯乙烯500、200、100 mg/kg后20 d，模型組血糖和血脂水平比給藥前明顯降低(P=0.05～0.01)，二苯乙烯組肝糖元水平比對照組提高8.06%～16.17%，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。二甲雙胍組肝糖元水平明顯低于二苯乙烯組，略低于對照組水平，結(jié)果提示，二甲雙胍降糖途徑可能與肝糖元合成關(guān)系不大。實驗結(jié)果表明，二苯乙烯能明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病癥狀。其機制可能與二苯乙烯能促進肝臟分解氧化血脂，合成肝糖元有關(guān)。

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