潘夢舒，郝 麗，鄭 云，丁 楠

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥230601)

有研究表明［1］，DN無論臨床表現(xiàn)為微量蛋白尿還是大量蛋白尿，均伴有足細(xì)胞數(shù)目及密度減少、足細(xì)胞的寬度增加;且足細(xì)胞數(shù)目及密度減少與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，足細(xì)胞減少嚴(yán)重者腎小球硬化及血清肌酐水平升高的發(fā)生率均明顯增高。足細(xì)胞及其裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin在腎臟正常生理功能以及DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2～6］。多項(xiàng)研究結(jié)果表明［7，8］，冬蟲夏草(CS)及其制劑通過降血糖、血壓和調(diào)節(jié)血脂、減少腎細(xì)胞凋亡、拮抗腎組織纖維化等機(jī)制對發(fā)揮治療DN的作用，但其保護(hù)腎臟的機(jī)制是否與其改善DN足細(xì)胞病變有關(guān)，目前尚無確切資料證實(shí)。2009年，我們通過建立DN大鼠模型，觀察CS對DN大鼠腎足細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 雄性SD大鼠60只，18～20周齡，重180～200 g。人工CS菌粉(江西濟(jì)民有限制藥公司提供)。鏈尿佐菌素(STZ)，臨用前溶解在0.01 M枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5。兔抗大鼠Nephrin單克隆抗體、兔抗大鼠Podocin多克隆抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及建模 所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，各20只。A組為正常對照組，B組為DN模型組;C組為CS干預(yù)組。B、C組根據(jù)中外文獻(xiàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，以隨機(jī)血糖為≥16.7 mmol/L，尿糖 +++～++++視為糖尿病模型制作成功，4周后監(jiān)測24 h，尿蛋白定量在30 mg/24 h以上者，表示DN模型成功［9］。

1.2.2 給藥方法 DN模型成功后入組干預(yù)。C組給予CS菌粉5 g/(kg·d)灌胃(水泡后溫火熬成濃度為2 g/ml)。A、B組給予等量飲用水灌胃，1次/d。每周稱重調(diào)整用藥劑量，連續(xù)給藥8周。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)期間標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不用胰島素。

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 ①24 h尿白蛋白排泄量(UAER)測定:實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d留取大鼠24 h尿液，離心后保存于－80℃冰箱中，根據(jù)試劑盒說明書測定UAER。②腎小球、腎小管形態(tài)學(xué)檢查:大鼠處死前稱重，在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側(cè)頸總動脈插管注入4℃預(yù)冷NS，反復(fù)灌洗腎臟后游離。經(jīng)腎門冠狀面切取厚約2 mm的標(biāo)本，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，厚2 μm切片，行HE染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管改變。③足細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查:取1 mm3的腎組織，戊二醇固定，行透射電鏡檢查，觀察足細(xì)胞變化。④腎組織中Nephrin和Podocin染色方法:取8 mm3的腎組織，4%多聚甲醛固定，厚3 μm切片，行免疫熒光染色，觀察Nephrin和Podocin分布并拍照。采用JD-801D計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組腎小球內(nèi)Nephrin和Podocin的平均光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h UAER比較 A、B、C組24 h UAER分別為(36.92±3.48)、(108.06±15.73)、(65.40±8.95)mg/24 h，B 組 ＞C 組 ＞A 組(P 均 ＜0.01)。

2.2 各組腎組織病理改變 HE染色結(jié)果:A組為正常腎組織;B組腎小球肥大，腎小管變形;C組上述病理改變(腎小球肥大，腎小管變形)明顯減輕。

2.3 各組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 A組足細(xì)胞未見病理改變;B組足細(xì)胞足突融合，足突裂孔數(shù)減少、裂孔膜消失;C組足細(xì)胞損傷較B組明顯減輕，足細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。

2.4 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白分布情況 見表1。免疫熒光圖片及半定量分析顯示足細(xì)胞裂孔蛋白Nephrin和Podocin在A組沿腎小球毛細(xì)血管袢呈均勻連續(xù)的線狀分布;B組為彌散的顆粒狀分布，Nephrin和Podocin蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.01);C組與B組比較Nephrin和Podocin蛋白表達(dá)有明顯增加(P＜0.01)，表現(xiàn)為連續(xù)的線狀分布。

表1 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白光密度比較(±s)

表1 各組腎組織中Nephrin和Podocin蛋白光密度比較(±s)

注:與A組比較，*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01;與 B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 Nephine蛋白 Podocin 蛋白A組0.215±0.001 0.216±0.001 B 組 0.728±0.222＊＊ 0.773±0.231＊＊C 組 0.468±0.021＊△△ 0.477±0.019＊△△

3 討論

CS為麥角菌科真菌，富含氨基酸、多糖、有機(jī)酸、多種微量元素、核苷酸、肽類及甾醇類等成分［10，11］，可通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)機(jī)制，發(fā)揮減少尿蛋白、改善腎功能及減輕腎臟病理改變等作用［7，8，12］。

DN為糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)為尿蛋白排泄率增加、腎功能的進(jìn)行性減退直至發(fā)展為終末期腎病。蛋白尿不僅是DN腎小球損傷的標(biāo)志，而且是加速腎臟損害的重要原因。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CS可減少DN大鼠24 h UAER，減輕腎臟損害。

DN的發(fā)生與足細(xì)胞損傷有關(guān)［2～6］。足細(xì)胞是一組高度分化和特異化的細(xì)胞，通過稀疏的足突附著于腎小球基底膜，具有防止蛋白漏出、維持腎小球毛細(xì)血管袢完整性、對抗腎小球毛細(xì)血管內(nèi)流體壓力和維持腎小球基底膜結(jié)構(gòu)成分更新等功能。有研究表明［13，14］，DN 早期足細(xì)胞數(shù)目和密度已開始減少，隨病變加重而加重，足細(xì)胞病變不僅導(dǎo)致大量蛋白尿發(fā)生，且與K-W結(jié)節(jié)形成、腎小球硬化和腎功能損傷有關(guān)。足細(xì)胞相鄰足突間裂隙由裂孔隔膜連接，該膜上分布多種蛋白，主要包括Nphrin、Podocin蛋白等，又稱裂孔膜蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠隨著腎臟損害的進(jìn)展，其Nephrin蛋白的表達(dá)顯著降低，且與UAER增加有關(guān)。且發(fā)現(xiàn)DN時(shí)Nephrin呈顆粒狀分布，而在正常腎組織中呈斑點(diǎn)和(或)線狀分布。

我們發(fā)現(xiàn)，DN模型大鼠經(jīng)CS治療12周后，24 h UAER顯著減少，腎小球肥大、腎小管變形明顯減輕，足細(xì)胞的足突融合、裂孔隔膜消失、裂孔數(shù)目減少等病變明顯改善，Nephrin和Podocin表達(dá)明顯增加，提示CS具有保護(hù)DN大鼠足細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)Nephrin和Podocin蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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