馬 寧，徐化恩

(1河南省人民醫(yī)院，鄭州454000;2鄭州人民醫(yī)院)

細(xì)胞毒性化療藥物在晚期胃癌的治療中占有重要地位，化療藥物除具有殺死腫瘤細(xì)胞功能外，還有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmhTNF)能在殺滅腫瘤細(xì)胞的某些環(huán)節(jié)與化療藥物起協(xié)同或加強(qiáng)作用，從而起化療增敏作用。2009年6月～2010年12月，我們觀察了奧沙利鉑(OXA)聯(lián)合rmhTNF對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823細(xì)胞，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng);rmhTNF由第四軍醫(yī)大學(xué)和上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司合作，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然TNFalpha制成;OXA，50 mg/支;原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整為(4～5)×105/ml的單細(xì)胞懸液;以1.5 ml/孔接種培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄舊培養(yǎng)液，隨機(jī)分為A、B、C、D 組，分別加入含500 U/ml rmhTNF、12.5 μg/ml OXA、500 U/ml rmhTNF+12.5 μg/ml OXA及不加藥物的培養(yǎng)液1.0 ml;繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去舊培養(yǎng)液;PBS液沖洗3遍，用新制備的40 g/L多聚甲醛溶液固定。

1.2.2 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布與凋亡率。取各組單細(xì)胞懸液，4℃下以1 000 r/min離心5 min;加入4℃的70%冷乙醇，固定12 h以上;棄去乙醇，加入RNA酶消化;37℃水浴30 min后冰浴，采用碘化丙錠(PI)一步插入性DNA定量熒光染色法染色，以500目篩網(wǎng)過(guò)濾成合格的單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較行方差分析和LSD檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組BGC-823細(xì)胞周期及凋亡情況比較，見(jiàn)表1。

表1 各組BGC-823細(xì)胞周期及凋亡情況比較(%，±s)

表1 各組BGC-823細(xì)胞周期及凋亡情況比較(%，±s)

注:與 D 組比較，*P ＜0.05;與 A、B、D 組比較，#P ＜0.05

組別 G0/G1 S G2/M 細(xì)胞凋亡率A 組 25.49±0.83* 31.37±0.68* 45.32±0.97* 39.52±0.95*B 組 47.29±0.98* 30.02±0.53* 23.44±0.93* 15.29±0.91*C 組 19.45±0.94*#10.60±0.79*#71.47±1.32*# 60.37±0.99*#D組55.28±1.24 19.55±0.70 26.71±0.43 3.42±0.64

3 討論

化療藥物主要通過(guò)線粒體凋亡途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)。當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)通過(guò)各種機(jī)制引發(fā)線粒體功能結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)不可逆性開(kāi)放，使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，并與Apaf及dATP結(jié)合，活化Caspase-9而觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡［1］;線粒體內(nèi)膜完整性及通透性是維持線粒體功能的前提，線粒體內(nèi)膜損傷，通透性增加，可促進(jìn)細(xì)胞色素C和其他凋亡誘導(dǎo)因子的釋放［2，3］。胃癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)閾值較高，則該凋亡途徑不能進(jìn)行，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥不敏感。

研究發(fā)現(xiàn)［4，5］，化療聯(lián)合高濃度的 TNF-α 可治療一些難治性惡性腫瘤，同時(shí)可避免出現(xiàn)嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)，可能與TNF-α對(duì)細(xì)胞毒性化療藥物具有增敏作用有關(guān)。因此，有研究［6］應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然TNF，制成高活性、低毒性的rmhTNF。本研究結(jié)果顯示，OXA聯(lián)合rmhTNF作用胃癌細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞比率增加，而G0/1、S期細(xì)胞比率下降，細(xì)胞凋亡率為60.37%±0.99%，顯著高于單用OXA、rmhTNF，提示奧沙利鉑聯(lián)合rmhTNF可協(xié)同阻滯胃癌細(xì)胞處于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究［7］發(fā)現(xiàn)，rmhTNF通過(guò)糾正腫瘤細(xì)胞線粒體膜抵抗凋亡的能力，使該凋亡通路恢復(fù)，增加了胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。rmhTNF還可增加腫瘤細(xì)胞TNFR與TNF的結(jié)合率，有利于死亡受體途徑凋亡程序的啟動(dòng);并通過(guò)凋亡信號(hào)通路的交叉和反饋［8］，放大多種下游效應(yīng)Caspase的促凋亡作用。奧沙利鉑和rmhTNF分別激活不同的Caspase，并級(jí)聯(lián)和放大有關(guān)凋亡信號(hào)，因而對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了協(xié)同作用［9，10］。NF-кB 基因位于多藥耐藥基因上游，與啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。rmhTNF可抑制NF-кB表達(dá)，從而阻斷多藥耐藥基因轉(zhuǎn)錄，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，降低了其抗凋亡能力，從而達(dá)到了治療耐化療藥物腫瘤的目的［11］。

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