尤燕舞，黃海玲，林 栩

(1右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西百色533000;2右江民族醫(yī)學院組胚教研室)

腎素—血管緊張素(RAS)系統(tǒng)對水、電解質(zhì)平衡及血壓調(diào)節(jié)起重要作用，不同個體RAS的活性不同，也同時受系統(tǒng)組成成分的表達以及活性的影響。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有直接的縮血管作用，是RAS中最重要的活性介質(zhì)之一。研究證實，AngⅡ在人體中主要通過血管緊張Ⅱ1型受體(AT1R)發(fā)揮作用，決定AT1R蛋白表達的基因是否存在某種或某些變異，影響著AT1R的結(jié)構(gòu)及功能，從而影響RAS的活性效應。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE)催化AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，是RAS系統(tǒng)中的關鍵酶，可同時滅活有舒血管作用的緩激肽，與血管內(nèi)皮增生及多種細胞因子的作用密切相關。RAS中另一候選基因為血管緊張素原(AGT)基因，其第2外顯子704 T/C變異導致編碼產(chǎn)物第235號甲硫氨酸變?yōu)樘K氨酸(M235T)，AGT M235T多態(tài)與血漿AGT水平有關。2011年4～6月，本文對 AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性進行了研究，以確定其在桂西地區(qū)正常壯族人群中的分布。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 桂西地區(qū)壯族人150例，男78例、女72 例，年齡(42.6 ±11.2)歲，血常規(guī)、血脂及其他生化指標均在參考范圍內(nèi)，心電圖檢查正常，排除肝臟、腎臟、內(nèi)分泌和心腦血管疾病。研究對象均來自右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，為正常健康體檢者，且相互間無血緣關系。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集體檢健康者靜脈血3 ml，用 EDTA－K2抗凝，采用改良碘化鈉法提取白細胞基因組DNA，－86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AT1R基因 A1166C多態(tài)性檢測 采用PCR－RFLP 法。正引物為:5'－CACCATGTTTTGAGGTT－3'，負引物為:5'－CGAGTTTCTGACATTGTTC－3'。建立50 μl的反應體系后，放入PCR擴增儀:變性94℃ 300 s，退火50℃ 120 s，延伸72℃ 120 s，30個循環(huán)后，在72℃充分延伸10min，PCR產(chǎn)物在37℃用DdeⅠ水解過夜。電泳可見277 bp的等位基因11662A片段(切點消失)，等位基因11662C(切點存在)呈167 bp及110 bp兩個片段。

1.2.3 ACE基因I/D多態(tài)性檢測 采用直接PCR法。正引物為 5'－CTGGAGACCACTCCCATCCTTTC－3'，負 引 物 為 5'－GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT－3'。PCR 體系為50 μl。變性、退火和延伸條件分別為94℃ 1min，58℃ 2min，72℃ 2min，共30個循環(huán)。電泳可見D等位基因PCR擴增產(chǎn)物為190 bp，I等位基因PCR擴增產(chǎn)物為490 bp。

1.2.4 AGT基因 M235T多態(tài)性檢測 采用 PCR－RFLP 法。 正 引 物 5'－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3';負引物 5'－CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC－3'。PCR 體系為 50 μl。在 94 ℃ 變性 3min。冰浴后加入Taq酶2 U混勻，再加石蠟油30 μl，進行94℃ 15 s變性，65℃ 50 s退火，72℃ 45 s延伸，循環(huán)35次。Takara內(nèi)切酶TthⅢ 1酶切，65℃水浴3 h。電泳可見基因型有3種:純合子MM只見1條163 bp電泳帶，純合子TT可見140 bp電泳帶，雜合子TM可見163 bp、140 bp兩條電泳帶。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗和方差分析，用Hardy－Weinbery遺傳平衡定律確認各基因頻率是否達到遺傳平衡。以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 AT1R基因A1166C多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表1。

2.2 ACE基因I/D多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表2。

2.3 AGT基因M235T多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表3。

表1 不同種族AT1R基因A1166C多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

表2 不同種族ACE基因I/D多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

表3 不同種族AGT基因M235T多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

3 討論

腎素是一種酸性蛋白質(zhì)，由腎臟近球細胞合成和分泌后，經(jīng)腎靜脈進入血循環(huán)。血漿中的AGT為腎素底物，在腎素的作用下水解，產(chǎn)生一個十肽即血管緊張素Ⅰ。血管緊張素Ⅰ的血管活性非常低，但在經(jīng)過肺循環(huán)時，可在肺血管內(nèi)皮表面的ACE作用下水解，產(chǎn)生一個八肽即血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ在血漿、組織中的血管緊張素A作用下，失去一個氨基酸，成為七肽的血管緊張素Ⅲ。血管緊張素Ⅱ和血管緊張素Ⅲ與血管平滑肌、腎上腺皮質(zhì)等組織細胞的血管緊張素受體結(jié)合，引起相應的生理效應。血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后，可作用于全身多個系統(tǒng)，對心肌肥厚、心力衰竭、高血壓、血管疾病、糖尿病、腎臟疾病等的發(fā)生、發(fā)展均有重要作用。RAS系統(tǒng)相關基因的多態(tài)性近年來成為研究熱點，研究較多的是AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性。桂西地區(qū)作為少數(shù)民族聚居地，以壯族人群居多，本文研究桂西地區(qū)壯族人群RAS系統(tǒng)AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性的分布頻率，并與不同種族人群進行比較。

本文采用PCR－RFLP技術及 DNA測序法首次獲得了桂西地區(qū)壯族人群RAS系統(tǒng)AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性的分布情況。結(jié)果顯示，三者等位基因頻率在桂西地區(qū)壯族人群中分別為 92.0%、8.0%，53.3%、46.7%，13.3%、86.7%。與國外同類研究結(jié)果比較，桂西地區(qū)壯族人群AT1R基因A1166C基因型和等位基因頻率與土耳其人［1］比較有統(tǒng)計學差異，而與日本人［2］、中國其他地區(qū)人群［3，4］比較無統(tǒng)計學差異;桂西地區(qū)壯族人群ACE基因I/D基因型頻率與法國人［5］、土耳其人［1］比較有統(tǒng)計學差異，而等位基因頻率無統(tǒng)計學差異，基因型和等位基因頻率與黎巴嫩人［6］、巴林人［7］比較差異有統(tǒng)計學意義，而與蒙古族人［8］、日本人［2］比較差異均無統(tǒng)計學意義;桂西地區(qū)壯族人群AGT基因M235T基因型和等位基因頻率與法國人［5］、蒙古族人［8］、土耳其人［1］、波蘭人［9］比較差異有統(tǒng)計學意義，而與日本人［2］比較差異均無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果提示RAS系統(tǒng)基因多態(tài)性在不同種族間分布頻率存在差異，這種差異勢必會對RAS系統(tǒng)基因在一些疾病特別是地方高發(fā)性疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用造成一定的影響。

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