蔡 俊，王宏升

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林吉林132011)

近年研究發(fā)現(xiàn)，瘦素(leptin)及其特異性瘦素受體(OB-R)在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，提示其表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［1，2］。關(guān)于 leptin及其受體在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)中表達(dá)情況的研究不多，并且結(jié)果報(bào)道不一［3～6］。2010年 11月～2011年4月，我們通過(guò)RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)HCC及癌旁組織中l(wèi)eptin及OB-R mRNA和蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步研究leptin及其受體與HCC的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 HCC標(biāo)本33例，癌組織及癌旁組織標(biāo)本均取自術(shù)中，先切取癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm)，再切取癌組織。將取下的標(biāo)本迅速切成0．3 cm×0．3 cm×0．3 cm大小裝入凍存管中，經(jīng)液氮速凍后保存于液氮罐中。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，并記錄臨床資料，包括年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期等。其中男30例、女3例，年齡22 ～70(48．5 ±12．9)歲。

1．2 方法

1．2．1 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 取肝癌及癌旁組織 30 mg，用 RNeasy Mini kit(Qiagen，Valencia，CA)提取組織總RNA并用紫外分光光度計(jì)方法定量，用High Capacity RNA-to-cDNA Kit進(jìn)行cDNA合成(Applied Biosystems，USA)。取 cDNA 200 ng，用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。引物序列及產(chǎn)物大小如下:leptin上游引物5'-TTCTTGTGGCTTTGGCCCTA-3'，下游引物 5'-GGAGACTGACTGCGTGTGTGAAA-3'，132 bp;OB-R上游引物 5'-TGTTGTGAATGTCTTGTGCC-3'，下游引物 5'-TACTCCAGTCACTCCAGATTCC-3'，394 bp。β-actin 為內(nèi)參照檢測(cè)cDNA合成質(zhì)量。

1．2．2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 肝癌及癌旁組織勻漿，裂解液裂解后蛋白定量。取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，壓片曝光、顯影。leptin、OB-R和 β-actin抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定一抗?jié)舛取?/p>

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 leptin及 OB-R mRNA表達(dá) 見圖 1。leptin mRNA在癌和癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為66．7%(22/33)和87．9%(29/33);OB-R mRNA 在癌和癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為57．6%(19/33)和84．8%(28/33)。leptin及OB-R mRNA在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌組織(P＜0．05)。

圖1 leptin和OB-R mRNA在HCC中的表達(dá)

2．2 leptin及OB-R蛋白表達(dá) 見圖2。leptin蛋白在癌和癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為63．6%(21/33)和81．8%(27/33);OB-R蛋白在癌和癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為 48．5%(16/33)和 75．8%(25/33)。leptin和OB-R蛋白在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌組織(P ＜0．05)。

圖2 leptin和OB-R蛋白在HCC中的表達(dá)

2．3 與臨床病理特征的關(guān)系 對(duì)leptin和OB-R在肝癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)，包括年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小、臨床分期等進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示leptin和OB-R的表達(dá)與臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0．05)。

3 討論

leptin主要通過(guò)與外周組織器官表達(dá)的OB-R相結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。以往研究顯示，leptin與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，但是其作用是促進(jìn)還是抑制腫瘤仍然存在分歧。有研究認(rèn)為leptin、OB-R可促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用;也有研究者認(rèn)為，leptin、OB-R在腫瘤免疫中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。因此，leptin可能對(duì)于不同組織類型的腫瘤細(xì)胞具有不同的生物學(xué)作用。

leptin和OB-R在生物學(xué)功能方面的雙重作用已經(jīng)越來(lái)越多的引起學(xué)者們的關(guān)注，對(duì)于leptin和OB-R在HCC中的表達(dá)情況報(bào)道不一。為明確leptin和OB-R在HCC患者癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，我們采用更為靈敏的RT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)leptin和OB-R mRNA和蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，leptin和OB-R在癌旁組織中表達(dá)率均高于癌組織，兩者有顯著性差異，這與Wang等［3］應(yīng)用免疫組化方法對(duì)leptin和OB-R在HCC癌和癌旁組織中的表達(dá)研究結(jié)果一致。我們還對(duì)leptin和OB-R的表達(dá)與患者年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小和TNM分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果未見顯著性差異。

綜上所述，HCC及癌旁組織中均存在著leptin以及OB-R的雙重表達(dá)。其對(duì)于肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能的機(jī)制還需要我們?cè)谖磥?lái)的研究中繼續(xù)深入探討。

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