譚琳鎣 趙天平 國蘭琴 趙琛 劉慧榮 朱慧華 崔云華

衰老是生物體各種功能普遍衰弱，以及抵抗環(huán)境傷害和恢復體內(nèi)平衡能力降低的過程[1]。近年來，全球老年人口比重迅速上升[2]，探索衰老機理，延緩衰老、防治與衰老相關(guān)的疾病、提高老年人的生活質(zhì)量，對全球的經(jīng)濟發(fā)展和衛(wèi)生事業(yè)將帶來重大的影響。本研究采用自然衰老大鼠模型，觀察溫和灸“腎俞”穴對自然衰老大鼠肝組織原癌基因Rb(Rb)、原癌基因P53(P53)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、蛋白激酶C(PKC)表達的影響，以期進一步探討艾灸延緩衰老的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供的2月齡雄性清潔級SD (Sprauge-Dawley)大鼠共24只，SPF級，體重(160±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組8只、自然衰老組8只、艾灸組8只。

1.2 主要試劑與儀器

Rb原位雜交試劑盒、P53原位雜交試劑盒、Bcl-2原位雜交試劑盒、PKC原位雜交試劑盒、羊抗兔SABC試劑盒、羊抗小鼠SABC試劑盒、兔抗大鼠Rb多克隆抗體、小鼠抗大鼠P53單克隆抗體、小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗大鼠蛋白酶C單克隆抗體、DAB顯色試劑盒等選用武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；儀器包括恒溫雜交爐(OLS 200)、顯微鏡(OLYMPUS BH2)、Motic圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

1.3 造模方法

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在SPF級環(huán)境設(shè)施中正常飼養(yǎng)20個月，待其自然進入衰老期[4]。

1.4 分組與處理

正常組：正常情況下飼養(yǎng)9周。

自然衰老組：正常情況下飼養(yǎng)20個月。

艾灸組：溫和灸腎俞穴[3]，每日1次，每次5分鐘，5次為一療程，每療程結(jié)束后休息2天，再進行下一療程，共治療20個月。

1.5 標本采集

實驗結(jié)束后處死各組大鼠，摘取肝臟，分別置于液氮或10%中性甲醛固定液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 原位雜交方法檢測大鼠肝組織Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA的表達

原位雜交探針由復旦科技有限公司合成。引物序列、探針長度見表1。Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA原位雜交檢測按試劑盒說明書進行。

陰性對照：以預雜交液代替雜交液，并完成整個過程。

棕黃色為陽性信號，陰性對照無陽性著色。每張片子隨機采集3個視野，運用MOTIC圖象分析系統(tǒng)對陽性表達面積和陽性表達光密度進行分析。

表1 Rb、P53、Bcl-2、PKC引物序列與探針長度

1.6.2 免疫組化方法檢測大鼠肝組織Rb、P53、Bcl-2、PKC的蛋白表達

Rb、P53、Bcl-2、PKC蛋白免疫組化檢測按試劑盒說明書進行。

陰性對照：以抗體稀釋液代替第一抗體孵育，并完成整個操作。

棕黃色為陽性信號，陰性對照無陽性著色。每張片子隨機采集3個視野，運用MOTIC圖象分析系統(tǒng)對陽性表達面積和陽性表達光密度進行分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

各組均值以表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析，不符合方差分析條件的，采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Rb mRNA表達的影響

表2、圖1顯示，自然衰老組大鼠肝組織Rb mRNA陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組肝組織Rb mRNA陽性表達面積顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但未達到正常水平(與正常組比較P<0.05)。艾灸組肝組織Rb mRNA陽性表達光密度也顯著降低(P<0.01)，且與正常組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織P53 mRNA表達的影響

表3、圖2顯示，自然衰老組大鼠肝組織P53 mRNA陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織P53 mRNA陽性表達面積與陽性表達光密度均顯著低于自然衰老組 (P<0.05，P<0.01)，但均未達到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表2 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Rb mRNA表達的影響

表3 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織P53 mRNA表達的影響

2.3 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達的影響

表4、圖3顯示，自然衰老組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽性表達面積顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但未達到正常水平(與正常組比較P<0.05)。艾灸組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽性表達光密度也顯著增強(P<0.01)，且與正常組比較無顯著性差異(P>0.05)。

表4 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達的影響

2.4 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織PKC mRNA表達的影響

表5、圖4顯示，自然衰老組大鼠肝組織PKC mRNA陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織PKC mRNA陽性表達面積與陽性表達光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但均未達到正常水平(P<0.01，P<0.05)。

表5 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織PKC mRNA表達的影響

2.5 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Rb蛋白表達的影響

表6、圖5顯示，自然衰老組大鼠肝組織Rb蛋白陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Rb蛋白陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但與正常組比較仍有顯著性差異(P<0.01)。

表6 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Rb蛋白表達的影響

2.6 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織P53蛋白表達的影響

表7、圖6顯示，自然衰老組大鼠肝組織P53蛋白陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織P53蛋白陽性表達面積與陽性表達光密度均顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但與正常組比較仍有顯著性差異(P<0.01)。

表7 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織P53蛋白表達的影響

注： 與正常組比較：aP<0.01，與自然衰老組比較：bP<0.01

2.7 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達的影響

表8、圖7顯示，自然衰老組大鼠肝組織Bcl-2蛋白陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Bcl-2蛋白陽性表達面積與陽性表達光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但均未達到正常水平(P<0.01)。

表8 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織Bcl-2

2.8 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織PKC蛋白表達的影響

表9、圖8顯示，自然衰老組大鼠肝組織PKC蛋白陽性表達面積和陽性表達光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織PKC蛋白陽性表達面積與陽性表達光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01，P<0.05)，但均未達到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表9 溫和灸對自然衰老大鼠肝組織PKC

圖1 各組大鼠肝組織Rb mRNA的表達

圖2 各組大鼠肝組織P53 mRNA的表達

圖3 各組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA的表達

圖4 各組大鼠肝組織PKC mRNA的表達

圖5 各組大鼠肝組織Rb蛋白的表達

圖6 各組大鼠肝組織P53蛋白的表達

圖7 各組大鼠肝組織Bcl-2蛋白的表達

圖8 各組大鼠肝組織PKC蛋白的表達

3 討論

衰老的發(fā)生由多種信號觸發(fā)所致，腫瘤抑制基因是其中之一[4-7]。研究顯示：Rb、P53、Bcl-2、PKC與衰老關(guān)系密切。Rb、P53是一類負性細胞周期的調(diào)控蛋白，為延緩衰老的負相調(diào)控因子，抑制細胞增殖，使細胞停滯于G1期，參與細胞周期分裂、衰老與凋亡。在衰老的細胞中，Rb僅以其活性的低磷酸化的生長抑制形式存在[8]。P53是序列特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過直接或間接的方式活化或抑制其靶基因，介導細胞的生長停滯或凋亡。P53 mRNA較高水平表達于衰老細胞[9-12]。有學者研究發(fā)現(xiàn)Rb/P53細胞轉(zhuǎn)導通路相關(guān)基因及蛋白在衰老大鼠睪丸組織發(fā)生明顯改變，衰老大鼠睪丸組織P53、Rb基因表達明顯高于正常對照組(P<0.01)[13]。本研究結(jié)果顯示，自然衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及蛋白表達均顯著高于正常組，Rb、P53 mRNA及蛋白表達與衰老呈負相關(guān)；艾灸組(溫和灸20個月)大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及蛋白表達均顯著低于自然衰老組，提示溫和灸可抑制衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達。

Bcl-2、PKC為延緩衰老的正相調(diào)節(jié)因子，參與細胞的增殖、分化、存活與衰亡的調(diào)控。Bcl-2多位于細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生較多的位置，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等，與細胞的抗氧化自我保護關(guān)系密切。Bcl-2對各種刺激誘導的凋亡有阻抑效應(yīng)，又稱為長壽基因，通常被作為衰老檢測的參數(shù)指標[14]。在衰老細胞里，Bcl-2表達降低[15-17]。有實驗表明Bcl-2的過量表達能使多種造血細胞在去除生長因子后壽命延長[18]。PKC廣泛分布于哺乳動物的器官、組織和細胞中，參與多種細胞活動調(diào)控[19]?；罨腜KC能使蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，是細胞內(nèi)信號傳導過程中的關(guān)鍵分子之一。在衰老細胞內(nèi)，PKC的功能失調(diào)[20,21]，在細胞衰老的發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用[22]。本研究中，自然衰老大鼠肝組織Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表達均顯著低于正常組；艾灸組(溫和灸20個月)大鼠肝組織Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表達均顯著高于自然衰老組，提示溫和灸可促進衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達。

綜上所述，本文研究結(jié)果提示：自然衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白表達升高，Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白表達降低。溫和灸能抑制Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達，促進Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白的表達，這可能是溫和灸延緩衰老的途徑之一。

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