陳 娟 胡曉晴 劉永明 曾文高 倪厚杰 唐洲平

腦出血(intracerebral hem orrhage,ICH)發(fā)病率高,占急性腦血管病的20%～30%,急性期病死率可達(dá)30%～40%,是急性腦血管病中最高的[1]。本實(shí)驗(yàn)采用VII型膠原酶法制備大鼠腦出血模型,觀察模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)和腦組織病理學(xué)的改變,進(jìn)一步了解此模型特點(diǎn)為腦出血的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠40只,體重220～280 g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK(鄂)2004-2007]。主要設(shè)備：大鼠腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司),微量進(jìn)樣器(上海佳安分析儀器廠),牙科鉆(鄭州市一美牙科工業(yè)有限公司),恒溫冰凍切片機(jī)(沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司),顯微鏡(日本OLYPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 根據(jù)Rosenberg等[2]報(bào)道的膠原酶誘導(dǎo)ICH模型法建立大鼠尾狀核ICH模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn);6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(1m l/200 g),俯臥位將大鼠固定在江灣大鼠腦立體定位儀上,先將門齒掛在門齒鉤上,固定雙耳間線,再將門齒固定在門齒鉤上,使門齒鉤平面較耳間線平面低2.4 mm,使前囟和后囟位于同一平面上;頭顱頂部常規(guī)消毒后在雙耳間線與雙眼間線之間取正中矢狀切口1.5 cm,切開(kāi)至皮下;3%雙氧水腐蝕顱骨外膜,暴露前囟及冠狀縫;根據(jù)包新民圖譜[6]定位右側(cè)尾狀核(前囟右旁開(kāi)3.2 mm,硬腦膜下5.6mm,向后1.4mm),在此處用牙科鉆鉆一直徑約1.0mm的圓孔,深達(dá)硬腦膜表面;用微量注射器抽?、餍湍z原酶液1.5μl(內(nèi)含0.5 UⅦ型膠原酶),將微量注射器固定于定位儀上,沿鉆孔垂直進(jìn)針至硬腦膜下5.6mm處,將Ⅶ型膠原酶液緩慢推注入腦內(nèi),約5min,停針2 min,緩慢退出顱外;用骨蠟封閉顱骨鉆孔,防液體沿針道外溢,最后縫合皮下組織及皮膚。假手術(shù)組除不注射VII型膠原酶外,其余條件完全一致。假手術(shù)組和腦出血組大鼠清醒后按照Z(yǔ)ea Longa(0～4分)法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分[3],即0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀,活動(dòng)正常;1分：提尾時(shí)不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2分：行走時(shí)身體向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。1～3分視為模型制作成功。各組大鼠在1、3、7、14、28 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行1次行為學(xué)評(píng)分。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 各組大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后 ,ICH 后 1、3、7、14、28 d各時(shí)間點(diǎn)將大鼠斷頭取腦,oct膠包裹,于-80℃的異戊烷中速凍3～5 min,取出于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?連續(xù)冰凍腦組織切片(10 um),以針孔為中心行冠狀位切片;切片行常規(guī)HE染色,冰凍切片用多聚甲醛固定10～30 s,流水洗1～2 s,蘇木精液染色30～60 s,流水洗去蘇木精液 5～10 s,1%鹽酸乙醇 1～3 s,流水洗1～2 s,促藍(lán)液返藍(lán) 5～10 s,流水沖洗 15～30 s,0.5%伊紅染色 30～60 s,蒸餾水稍洗 1～2 s,80%乙醇1～2 s,95%乙醇 1～2 s,無(wú)水乙醇 1～2 s,石炭酸二甲苯 2～3 s,二甲苯(Ⅰ)2～3 s,二甲苯(Ⅱ)2～3 s,中性樹(shù)膠封固;在光鏡下觀察血腫及周圍組織學(xué)變化。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件包,組間采用t檢驗(yàn),P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量 本實(shí)驗(yàn)?zāi)X出血組共有6只大鼠被淘汰(其中4只于出血后48h死亡,考慮與嚴(yán)重腦水腫有關(guān);2只無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀,證實(shí)為血腫破入腦室而致),剔除上述情況后隨機(jī)補(bǔ)充,最終分析仍為40只大鼠。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)改變

假手術(shù)組的所有大鼠麻醉清醒后均無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0分,無(wú)明顯差異。腦出血組大鼠3d時(shí)神經(jīng)功能缺損癥狀最重,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分最高;1 d時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分即非常明顯,隨著時(shí)間延長(zhǎng),7 d時(shí)評(píng)分開(kāi)始降低,14 d時(shí)神經(jīng)功能缺損已不明顯。腦出血組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示3 d與1 d和7 d無(wú)明顯差異(P＞0.05),而3 d與14、28 d差異顯著(P＜0.05),且7 d與14、28 d時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異(P＞0.05)(圖1)。

圖1 腦出血組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示3 d時(shí)神經(jīng)功能缺損癥狀最重,3 d與1和7 d無(wú)明顯差異(P＞0.05),而3 d與14、28 d差異顯著(P＜0.05),7 d與14、28 d時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異(P＞0.05)

2.3 腦組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

假手術(shù)組：僅在針道周圍見(jiàn)少量散在的血細(xì)胞,以后可見(jiàn)少量增生的膠質(zhì)細(xì)胞,其余部位無(wú)明顯病理改變,見(jiàn)圖2。腦出血組：腦出血1d時(shí)尾狀核即形成明顯的類圓形或不規(guī)則形血腫,血腫中心區(qū)有散在的神經(jīng)細(xì)胞,周邊區(qū)有水腫,可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);3 d時(shí)病灶區(qū)血腫仍明顯存在,腦組織明顯水腫,可見(jiàn)細(xì)胞間隙增寬,神經(jīng)元腫脹、胞核溶解甚至消失,見(jiàn)圖3;7 d時(shí)血腫血細(xì)胞溶解增多,水腫減輕,細(xì)胞排列不整齊,核形態(tài)不規(guī)則,部分核皺縮,血腫及周圍神經(jīng)元減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生,毛細(xì)血管增多,腦組織液化壞死,正常腦組織逐漸消失,見(jiàn)圖4;14 d時(shí)類圓形或不規(guī)則的血腫形成了囊腔,見(jiàn)圖5;28 d時(shí)囊腔仍在,周邊區(qū)見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步增生,見(jiàn)圖6。

圖2 假手術(shù)組幾乎正常(HE染色×400倍)

圖3 腦出血模型3 d血腫周圍腦組織細(xì)胞損害明顯,細(xì)胞腫脹,腦組織松散,顯微鏡下囊腔增多(HE染色,×400倍)

圖4 腦出血模型7 d星型膠質(zhì)細(xì)胞增多,腦組織液化(HE染色×400倍)

圖5 腦出血模型14 d,血腫不規(guī)則囊腔形成(HE染色×400倍)

圖6 腦出血模型28 d血腫囊腔仍然存在,周圍膠質(zhì)細(xì)胞增多(HE染色×400倍)

3 討 論

動(dòng)物模型的成功選擇是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,目前國(guó)內(nèi)外比較常用腦出血模型制作方法主要有四種[4]：自體血注入法、膠原酶誘導(dǎo)法、微氣囊充脹法、自發(fā)性腦出血模型。自體血注入法用于大鼠時(shí)的重復(fù)性差,尤其是注血量、血腫大小與部位難以掌握,所致血腫形態(tài)不一,常伴有血液外滲到胼胝體白質(zhì)及腦室內(nèi)。微氣囊充脹法未涉及到出血和腦實(shí)質(zhì)之間的重要關(guān)系,且無(wú)血管活性因子的作用,故其與臨床脫節(jié)太多,現(xiàn)已較少應(yīng)用。自發(fā)性腦出血模型亦因出血的發(fā)生、出血量及部位的不可靠而使其應(yīng)用受到限制。膠原酶誘導(dǎo)法制作方法簡(jiǎn)單,快捷且重復(fù)性好,與人類腦出血病理、生化和病理生理學(xué)有許多相似性[5],且這種模型可產(chǎn)生長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)缺陷,為研究腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)和評(píng)價(jià)藥物療效提供了一個(gè)有用的模型[6]。故本實(shí)驗(yàn)采取了此種模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腦出血后1 d時(shí)即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀,3 d時(shí)神經(jīng)功能缺損癥狀最明顯,可能與腦出血后腦水腫有關(guān),這與以往的研究結(jié)果一致。7 d時(shí)行為學(xué)評(píng)分下降,腦出血后14 d時(shí)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀逐漸恢復(fù)。組間比較,腦出血7 d以后已無(wú)顯著差異。分析原因可能有大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)能力強(qiáng),而腦出血后神經(jīng)行為學(xué)有自然恢復(fù)的過(guò)程[7];另外Longa評(píng)分法較粗糙,不能精確顯示各組評(píng)分,且分值差距較小。腦出血的病理生理改變除血腫本身的占位性損害外,尚有周圍腦組織血液循環(huán)障礙、代謝紊亂如酸中毒、血管運(yùn)動(dòng)麻痹、血腦屏障受損及血液分解產(chǎn)物釋放多種生物活性物質(zhì)對(duì)腦組織的損害。本實(shí)驗(yàn)觀察到隨血細(xì)胞的滲出,腦水腫加劇,血腫部位出現(xiàn)明顯的小裂隙,隨著時(shí)間延長(zhǎng),血細(xì)胞吸收,這些裂隙擴(kuò)大并匯合成囊腔,囊腔周圍有膠質(zhì)細(xì)胞增生,隨后囊腔一直存在。

本實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)了腦出血后血腫的形成、血細(xì)胞的吸收、膠質(zhì)細(xì)胞增生、囊腔形成等動(dòng)態(tài)演變過(guò)程,這些變化過(guò)程結(jié)合大鼠腦出血模型為腦出血基礎(chǔ)研究及藥物干預(yù)治療時(shí)間窗提供了依據(jù)。

1 吳 江.神經(jīng)病學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社,2005.170.

2 Rosenberg GA,Mun-Bryce S,W esley M.et al.Collagenase--induced intracerebral hem orrhage in rats.Stroke,l990,2l(5)：80l-807.

3 Zea Longa E1,Weinstein PR,Carlson S,et a1.Reversiblem iddle cereb ral artery occ lusion w ithou t cranectomy in rat.Stroke,1989,20(10)：84-91.

4 張化彪,張?zhí)K明.腦出血模型.國(guó)外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè),2002,11(10)：469-471.

5 許 東,文玉軍,張蓮香,等.膠原酶注入小鼠尾狀核建立腦出血模型.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2006,14(1)：36-39.

6 李紅玲,李玉敏,楊 靜.自體血注入法和膠原酶注入法誘導(dǎo)腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷谋容^.中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(8)：148-150.

7 Ji XH,Li nJ,Wang J.Efect of early rehabilitation intervention on nerve fun ctionrehabilitation of cereb ral hemor rhage patients in recovery stage.Zhong Guo Lin Chuang Kang Fu(Chin JC lin Rehabil),2002,6(11)：1701.