韓 麗 常建民 張柏林 孫 薇 王 雨

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

20世紀(jì)80年代以來，化學(xué)藥劑防治木材藍(lán)變引起的環(huán)境污染等一系列問題日益引起世界各國政府的廣泛關(guān)注，尋找對環(huán)境友好、無毒高效的防治技術(shù)成為木材保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生物防治被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐渭夹g(shù)之一，而基礎(chǔ)是獲得高效生防菌株并使其作用充分發(fā)揮［1－5］。枯草芽孢桿菌由于抗逆性強(qiáng)、抗菌譜廣泛，被認(rèn)為是理想生防菌來源之一，在植物病害生物防治領(lǐng)域已得到了廣泛的研究與應(yīng)用，但用于木材藍(lán)變防治的研究還較少［6－8］。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B26是北京林業(yè)大學(xué)木材生物防治實驗室分離、篩選、鑒定和保存的一株優(yōu)良生防細(xì)菌［9］。在前期平板試驗和室內(nèi)木片試驗中，B26菌株對白樺木材藍(lán)變菌表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，顯示了較高的研究價值和應(yīng)用潛能。由于生防菌對病原菌的抑制效果不僅取決于菌株本身，還取決于外界條件，包括培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。因此本研究采用單因素試驗和正交試驗對B26菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到其最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件，以期為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌枯草芽孢桿菌B26和病原菌綠色木霉均由北京林業(yè)大學(xué)木材生物防治實驗室分離、篩選、鑒定和保存。

種子液培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，抑菌活性檢測培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，制備方法參考張紀(jì)忠方法［10］。

碳、氮源試驗專用培養(yǎng)基:(NH4)2SO42 g、NaH2PO40.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.20 g、CaCl20.10 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 研究方法

1.2.1 種子液制備

將斜面保存的B26菌株接一環(huán)到種子液培養(yǎng)基中，裝液量100 mL(容器容量250 mL)，溫度(28±1)℃，轉(zhuǎn)速110 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h后，按5%的接種量接入不同條件下的發(fā)酵培養(yǎng)液中，進(jìn)行相關(guān)單因素的發(fā)酵試驗。

1.2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用碳、氮源試驗專用培養(yǎng)基，分別以不同碳源(乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精)和不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NaNO3)替代培養(yǎng)基中的碳氮源，其他成分固定不變，裝液量100 mL(容器容量250 mL)，接種量5%，溫度(28±1)℃、速度110 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h后檢測不同碳源、氮源對B26菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。每處理3次重復(fù)。

在單因子試驗基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，采用L9(34)正交表安排試驗，明確碳源、氮源、CaCl2、MgSO4·7H2O的最適添加量。每處理3次重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用1.2.2優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別檢測不同培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量和培養(yǎng)時間對B26菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.2.4 發(fā)酵液抑菌活性檢測方法

取不同發(fā)酵條件下振蕩培養(yǎng)48h的發(fā)酵液，在4℃、9 000 r/min下，離心20 min，去除大量菌體和雜質(zhì)，取其上清液，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用孔碟法檢測發(fā)酵液抑菌活性［11］。具體操作為:配制病原真菌的孢子懸浮液，取2 mL移至培養(yǎng)皿中。將冷卻到約45℃的PDA培養(yǎng)基倒于培養(yǎng)皿中(約20 mL)，搖均，在離培養(yǎng)平板邊緣2 cm的地方用內(nèi)徑為6 mm的打孔器打孔，每皿打4個孔(孔間距離為2 cm)。將25 μL的發(fā)酵上清液置于孔中，在28℃下培養(yǎng)4～7 d，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源和氮源對B26菌株抑菌活性的影響

對常見的6種碳源:乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精(碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%)的研究結(jié)果見表1?？芍囵B(yǎng)基中碳源種類不同，B26菌株發(fā)酵液對變色菌抑制效果不同，以蔗糖為碳源時，發(fā)酵液抑菌活性最佳，抑菌圈直徑可達(dá)到17.02 mm;其后依次是葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、乳糖、麥芽糖。

對常見5種氮源:牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NaNO3(有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，無機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)的研究結(jié)果見表2。可知，B26菌株對有機(jī)氮源的利用普遍好于無機(jī)氮源。在有機(jī)氮源中，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵液抑菌活性最佳，抑菌圈直徑可達(dá)18.16 mm;在無機(jī)氮源中，以NaNO3為氮源的發(fā)酵液抑菌活性最好，抑菌圈直徑為13.62 mm。

表1 不同碳源對B26菌株抑菌活性的影響

表2 不同氮源對B26菌株抑菌活性的影響

2.1.2 培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

通過上述碳源和氮源單因素試驗的研究，確定了液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源和氮源的種類。為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，選取發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分蔗糖、蛋白胨、CaCl2、MgSO4·7H2O，進(jìn)行L9(34)正交試驗。正交試驗各因素及水平見表3，統(tǒng)計結(jié)果及方差分析見表4與表5。由表4中R值可看知，影響B(tài)26菌株發(fā)酵液抑菌活性的因素依次為:B(蛋白胨)＞A(蔗糖)＞D(MgSO4·7H2O)＞C(CaCl2)。結(jié)合K值，本研究中選出的最佳培養(yǎng)基組合為B1A1D3C2，即蔗糖1.5%、蛋白胨1.5%、CaCl20.15%、MgSO4·7H2O 0.20%。

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗因素水平

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

表5 正交設(shè)計方差分析

由表5中的方差分析可知:FB(6.78)＞FA(6.13)＞FD(5.90)＞FC(2.83)，表明蔗糖、蛋白胨、CaCl2、MgSO4·7H2O對發(fā)酵液抑菌活性的影響均不顯著。

2.2 培養(yǎng)條件

2.2.1 溫度對B26菌株抑菌活性的影響

將 B26菌株分別置于 20、25、30、35、40、45 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)，測定培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見表6?？芍?，溫度對B26菌株發(fā)酵液抑菌活性有一定影響。在20～45℃范圍內(nèi)，發(fā)酵液的抑菌活性相差不大，在35℃時菌株發(fā)酵液抑菌活性最高。隨著溫度的進(jìn)一步升高，發(fā)酵液抑菌活性急劇下降，說明溫度過高或過低都不利于B26菌株的發(fā)酵。

表6 溫度對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.2 裝液量對B26菌株抑菌活性的影響

將 B26 菌株接入分別裝入 30、60、90、120、150、180 mL 培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，比較不同裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響(見表7)。結(jié)果表明，裝液量為120 mL時，菌株發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，說明該菌株為好氧菌，發(fā)酵液抑菌活性與通氣條件有一定要求，裝液量過少或過大，都不利于菌株的發(fā)酵。

表7 裝液量對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.3 轉(zhuǎn)速對B26菌株抑菌活性的影響

搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為 90、110、130、150、170、190 r/min，結(jié)果見表8。在轉(zhuǎn)速為130 r/min時，B26菌株發(fā)酵液抑菌活性最好，抑菌圈直徑可達(dá)16.36 mm。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過170 r/min時，發(fā)酵液的抑菌活性顯著下降，說明轉(zhuǎn)速太高不利于菌株生長，可能會導(dǎo)致菌體細(xì)胞機(jī)械損傷而影響其生長，或引起菌體自溶，從而對發(fā)酵抑菌活性產(chǎn)生很大的影響。

表8 搖瓶轉(zhuǎn)速對B26菌株抑菌活性的影響

表9 初始pH對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.4 初始pH對B26菌株抑菌活性的影響

測定了 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 等不同初始 pH 值對B26菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響(見表9)。結(jié)果表明，pH為7.5時菌株發(fā)酵液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達(dá)19.00 mm。當(dāng)pH為6.5～8.0時，B26菌株發(fā)酵液抑菌活性較高，說明中性及弱堿性的培養(yǎng)條件更有利于B26菌株對病原菌的抑制作用。

2.2.5 接種量對B26菌株抑菌活性的影響

分采用2%、4%、6%、8%、10%、12%等6個接種量梯度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測定接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響(見表10)?？梢姡谝欢ǚ秶鷥?nèi)菌株抑菌活性隨接種量的增加而增加，接種量在8%時發(fā)酵液抑菌活性最高，當(dāng)接種量大于10%，發(fā)酵液抑菌活性開始降低。因此最適接種量為8%。

表10 接種量對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.6 發(fā)酵時間對B26菌株抑菌活性的影響

從表11中可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液的抑菌活性呈上升趨勢，在培養(yǎng)36～72 h內(nèi)抑菌活性最大并呈平穩(wěn)趨勢，其中72 h時發(fā)酵液抑菌活性最大，之后發(fā)酵液活性呈現(xiàn)下降趨勢。因此菌株以培養(yǎng)72 h最為適宜。

表11 發(fā)酵時間對B26菌株抑菌活性的影響

3 結(jié)論

通過對枯草芽孢桿菌B26液體發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了菌株抑菌活性最高的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件:蔗糖1.5%+蛋白胨 1.5%+CaCl20.15%+MgSO4·7H2O 0.20%;溫度為 35℃、初始pH值7.5、裝液量120 mL、接種量8%、轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵時間72 h。在該優(yōu)化條件下，發(fā)酵液抑菌圈直徑從最初的12.40 mm提高到了19.00 mm，抑菌活性比優(yōu)化前提高了53%。優(yōu)化得到的培養(yǎng)基成分是工業(yè)生產(chǎn)中較常用的原料，培養(yǎng)條件在工業(yè)生產(chǎn)中也較易達(dá)到，這為B26菌株的發(fā)酵罐放大試驗提供了理論依據(jù)，也為菌株的進(jìn)一步工業(yè)化開發(fā)打下基礎(chǔ)。

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