許益笑，王德選，盧立肖，楊宇真，楊青，王麗，熊錫山

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院 腎內(nèi)科325027；3.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 腎臟病研究所，上海 200003）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是缺血性急性腎損傷最主要的病理生理變化之一，常見(jiàn)于新生兒窒息、肺炎、休克及腎移植、腎切開(kāi)取石術(shù)等[1]，其發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，至今仍未被完全闡明。左卡尼?。↙-carnitine）又名左旋肉堿， 可通過(guò)提高位于線(xiàn)粒體膜上卡尼汀脂酰轉(zhuǎn)移酶的活性，促進(jìn)脂肪酸代謝。有報(bào)道稱(chēng)其對(duì)心肌缺血再灌注損傷及腦缺血過(guò)程中具明顯保護(hù)作用[2-3]，但對(duì)于其在RIRI中的作用研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用在體大鼠腎缺血再灌注模型，從3個(gè)再灌注時(shí)間點(diǎn)觀察腎功能、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、鈉鉀ATP酶的變化及腎組織的超微結(jié)構(gòu)改變，探討左卡尼汀對(duì)RIRI的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 雄性SD大鼠48只，重250～300 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。左卡尼汀注射液由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)（5 mL/g，批號(hào)為0003271）。FFA、鈉鉀ATP酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。其余均為市售分析純品。

1.2 模型制備和分組 實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，腹部備皮，腹正中切口打開(kāi)腹腔，暴露腎臟，分離左腎動(dòng)、靜脈，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈，腎臟由紅變紫黑色表示夾閉成功；同樣方法暴露右腎并切除。45 min后放開(kāi)血管夾，見(jiàn)腎臟顏色由紫黑變?yōu)榉奂t后，關(guān)閉腹腔并放回鼠籠，維持室溫37 ℃，予正常飲食，再灌注1 h、6 h、12 h，復(fù)制腎缺血再灌注損傷模型[4]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和左卡尼汀治療組（治療組）兩大組，治療組缺血前15 min及再灌注后40 min兩次尾靜脈注射左卡尼汀500 mg·kg-1[5]，對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)注射等量0.9%氯化鈉溶液。每大組再分成4小組，即：①假手術(shù)組：僅行右腎摘除，左腎暴露45 min后取下；②缺血再灌注1 h組（IR1h組）；③缺血再灌注6 h組（IR6h組）；④缺血再灌注12 h組（IR12h組），每小組6只。各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血樣后處死摘取左腎。

1.3 血清尿素氮（Bun）和肌酐（Scr）檢測(cè) 各組動(dòng)物左腎切除前眼睛框后取血，注入空白離心管，于4 ℃，3000 r/min離心10 min后取上清送第二軍醫(yī)大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心檢測(cè)血Bun和Scr。

1.4 腎皮質(zhì)組織FFA含量、鈉鉀ATP酶活力檢測(cè)各組大鼠在試驗(yàn)結(jié)束后迅速摘取左腎，沿冠狀面切開(kāi)，于靠近下極處切取腎皮質(zhì)組織約200 mg，加生理鹽水制成2%的勻漿，4 ℃ 3500 r/min離心5 min，取上層清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)FFA含量和鈉鉀ATP酶活力。

1.5 電鏡觀察 于左腎靠近下極處切取約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織數(shù)塊，予2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水，純環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑浸透2 h，包埋聚合后超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色10 min，H-7500型透射電鏡（日本HITACH公司生產(chǎn)）觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 血清Bun、Scr含量的改變 對(duì)照組和治療組大鼠血清Bun、Scr水平均隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。對(duì)照組的BUN、Scr均于再灌注6 h后開(kāi)始與假手術(shù)組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）；治療組再灌注12 h的BUN（P<0.05）和再灌注6、12 h的Scr也顯著高于假手術(shù)組（P<0.05和P<0.01），但低于相應(yīng)對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清Bun、Scr含量的比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠血清Bun、Scr含量的比較（±s，n=6）

與假手術(shù)組比：*P<0.05，**P<0.01；與對(duì)照組比：△△P<0.01

組別假手術(shù)組IR1h組IR6h組IR12h組BUN(mmol·L-1)Scr(μmol·L-1)對(duì)照組9.9±1.5 10.6±2.1 15.2±3.5*22.7±5.9**治療組9.7±2.8 10.2±2.9 13.0±5.2 15.6±4.4*△△對(duì)照組36±16 49±8 75±15**112±18**治療組37±19 44±13 62±9*△△87±11**△△

2.2 腎皮質(zhì)組織FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的改變隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腎組織中FFA含量逐漸升高，再灌注12 h后與相應(yīng)假手術(shù)組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；鈉鉀ATP酶活力逐漸下降，再灌注6 h后與相應(yīng)的假手術(shù)組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。治療組再灌注12 h后鈉鉀ATP酶活力顯著高于相應(yīng)對(duì)照組（P<0.01)；而FFA含量較相應(yīng)對(duì)照組下降（P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化 假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞胞漿中存在大量線(xiàn)粒體（箭頭），極少見(jiàn)變性空泡，無(wú)斷裂，嵴間隙清晰可見(jiàn)，色深，細(xì)胞核無(wú)明顯固縮，見(jiàn)圖1①。IR12h對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)量明顯減少、腫脹，嵴模糊，大量空泡變性（箭頭），細(xì)胞核明顯固縮，見(jiàn)圖1②。IR12h治療組腎小管上皮細(xì)胞胞漿線(xiàn)粒體較豐富，部分腫脹（箭頭），少見(jiàn)空泡變性，嵴可見(jiàn)，細(xì)胞核輕微固縮，見(jiàn)圖1③。

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的比較（±s，n=6）

與假手術(shù)組比：*P<0.05，**P<0.01；與對(duì)照組比：△P<0.01

組別假手術(shù)組IR1h組IR6h組IR12h組FFA(μml·mg-1prot)對(duì)照組27.67±7.12 29.50±9.24 33.43±7.74 53.43±9.31**治療組23.85±5.11 28.87±6.54 30.12±9.03 41.95±4.60**△鈉鉀ATP酶活力（U·mg-1 prot）對(duì)照組0.985±0.273 0.916±0.33 0.549±0.166*0.394±0.092**治療組0.950±0.287 0.921±0.294 0.670±0.181**0.581±0.074**△

圖1 腎近曲小管上皮細(xì)胞超微機(jī)構(gòu)（×17000）

3 討論

左卡尼汀是一種氨基酸衍生物，可由人體內(nèi)源性產(chǎn)生或自肉類(lèi)食品中攝取。它本身并非機(jī)體的基本營(yíng)養(yǎng)素，而是脂肪酸進(jìn)入線(xiàn)粒體進(jìn)行β-氧化所必需的輔助因子，可加速轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸通過(guò)線(xiàn)粒體內(nèi)膜，進(jìn)入線(xiàn)粒體進(jìn)行β氧化供能，與脂肪酸的利用及能量生成密切相關(guān)。因其對(duì)心肌缺血低氧的保護(hù)作用受到公認(rèn)[6]，左卡尼汀在臨床上已開(kāi)始應(yīng)用于心肌梗死、中重度心力衰竭及體外循環(huán)手術(shù)患者。但關(guān)于其在RIRI中的作用，目前尚知之甚少。

因腎移植患者多為雙側(cè)腎功能?chē)?yán)重衰竭，本實(shí)驗(yàn)采用右腎切除，左腎單側(cè)缺血再灌注的RIRI模型，更貼近腎移植患者的臨床實(shí)際。結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠血Bun、Scr明顯升高，且此改變隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而更加明顯，提示大鼠的腎功能在再灌注后顯著受損；腎超微結(jié)構(gòu)顯示腎小管上皮細(xì)胞腫脹，大量空泡變性，細(xì)胞核明顯固縮，以上表明本次RIRI造模成功。而應(yīng)用左卡尼汀后IR6h、IR12h治療組大鼠血Bun、Scr較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組顯著下降，超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)組織損傷也明顯減輕，說(shuō)明左卡尼汀可改善腎功能，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，從而減輕腎缺血再灌注損傷。

臟器缺血再灌注可從多個(gè)方面造成組織損傷，其中代謝受阻、能量不足是主要原因之一。缺血后，組織有氧氧化受阻，能量供應(yīng)嚴(yán)重不足造成損傷，糖酵解的加速雖可提供ATP，但同時(shí)生成的大量酸性產(chǎn)物可誘發(fā)鈣超載，導(dǎo)致線(xiàn)粒體嚴(yán)重受損，進(jìn)一步干擾能量代謝。腎臟血供豐富，占心輸出量的20%～25%；就單位重量而言，其氧耗僅次于心臟，機(jī)能活動(dòng)極為旺盛，故能量代謝紊亂對(duì)RIRI的發(fā)生發(fā)展影響很大。Li等[7]報(bào)道RIRI時(shí)鈉鉀ATP酶活性受抑，可致細(xì)胞毒性水腫，線(xiàn)粒體、溶酶體膜破裂。脂肪酸為腎皮質(zhì)的主要能源物質(zhì)，特別是手術(shù)后或者急性腎損傷后，多種激素分泌增加可使體內(nèi)糖原迅速分解，此時(shí)脂肪酸的供能作用更加重要。心肌缺血后，脂肪酸β-氧化的生理抑制劑丙二酰CoA水平下降，至再灌注30 min后達(dá)最低，導(dǎo)致缺血再灌注后脂肪酸的氧化迅速恢復(fù)且其氧化速率超過(guò)缺血前的水平[8]，提示脂肪酸氧化供能可能在缺血再灌注后的能量供應(yīng)中占重要地位。此外，脂肪酸的氧化更是血管內(nèi)皮細(xì)胞唯一的能量來(lái)源，而左卡尼汀又是脂肪酸氧化途徑中必不可少的輔助因子，因此左旋卡尼汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。早在20世紀(jì)90年代，Hulsmann等[9]的研究就指出，內(nèi)皮細(xì)胞在缺血期易向外釋放卡尼汀，且細(xì)胞內(nèi)剩余卡尼汀活性明顯下降，而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血前補(bǔ)充左旋卡尼汀可增加冠狀動(dòng)脈的血流量，改善缺血后的心功能[10]。

本研究結(jié)果表明，對(duì)照組再灌注后FFA含量逐漸升高，鈉鉀ATP酶活力逐漸下降，與假手術(shù)組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示線(xiàn)粒體數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，提示RIRI后線(xiàn)粒體破壞明顯，F(xiàn)FA分解受阻堆積，能量生成障礙。應(yīng)用左卡尼汀之后，F(xiàn)FA較對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)明顯下降，鈉鉀ATP酶活力明顯升高，腎功能得到顯著改善，超微結(jié)構(gòu)顯示線(xiàn)粒體數(shù)量增多，損傷減輕，表明左卡尼汀能有效保護(hù)腎功能，抑制腎缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與左卡汀促進(jìn)FFA進(jìn)行β-氧化，清除脂肪酸代謝的旁路產(chǎn)物及其他細(xì)胞內(nèi)毒性[11]，保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，減輕內(nèi)皮損傷有關(guān)。

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