許益笑，王德選，盧立肖，楊宇真，楊青，王麗，熊錫山

（1.溫州醫(yī)學院 病理生理學教研室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學院附屬育英兒童醫(yī)院 腎內科325027；3.上海長征醫(yī)院 腎臟病研究所，上海 200003）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是缺血性急性腎損傷最主要的病理生理變化之一，常見于新生兒窒息、肺炎、休克及腎移植、腎切開取石術等[1]，其發(fā)生機制極其復雜，至今仍未被完全闡明。左卡尼?。↙-carnitine）又名左旋肉堿， 可通過提高位于線粒體膜上卡尼汀脂酰轉移酶的活性，促進脂肪酸代謝。有報道稱其對心肌缺血再灌注損傷及腦缺血過程中具明顯保護作用[2-3]，但對于其在RIRI中的作用研究甚少。本實驗利用在體大鼠腎缺血再灌注模型，從3個再灌注時間點觀察腎功能、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、鈉鉀ATP酶的變化及腎組織的超微結構改變，探討左卡尼汀對RIRI的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性SD大鼠48只，重250～300 g，由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。左卡尼汀注射液由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)（5 mL/g，批號為0003271）。FFA、鈉鉀ATP酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余均為市售分析純品。

1.2 模型制備和分組 實驗前禁食12 h，自由飲水，戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，腹部備皮，腹正中切口打開腹腔，暴露腎臟，分離左腎動、靜脈，無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，腎臟由紅變紫黑色表示夾閉成功；同樣方法暴露右腎并切除。45 min后放開血管夾，見腎臟顏色由紫黑變?yōu)榉奂t后，關閉腹腔并放回鼠籠，維持室溫37 ℃，予正常飲食，再灌注1 h、6 h、12 h，復制腎缺血再灌注損傷模型[4]。

實驗動物隨機分為對照組和左卡尼汀治療組（治療組）兩大組，治療組缺血前15 min及再灌注后40 min兩次尾靜脈注射左卡尼汀500 mg·kg-1[5]，對照組同時點注射等量0.9%氯化鈉溶液。每大組再分成4小組，即：①假手術組：僅行右腎摘除，左腎暴露45 min后取下；②缺血再灌注1 h組（IR1h組）；③缺血再灌注6 h組（IR6h組）；④缺血再灌注12 h組（IR12h組），每小組6只。各組動物實驗結束時取血樣后處死摘取左腎。

1.3 血清尿素氮（Bun）和肌酐（Scr）檢測 各組動物左腎切除前眼睛框后取血，注入空白離心管，于4 ℃，3000 r/min離心10 min后取上清送第二軍醫(yī)大學新藥評價中心檢測血Bun和Scr。

1.4 腎皮質組織FFA含量、鈉鉀ATP酶活力檢測各組大鼠在試驗結束后迅速摘取左腎，沿冠狀面切開，于靠近下極處切取腎皮質組織約200 mg，加生理鹽水制成2%的勻漿，4 ℃ 3500 r/min離心5 min，取上層清液，按試劑盒說明書操作測FFA含量和鈉鉀ATP酶活力。

1.5 電鏡觀察 于左腎靠近下極處切取約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織數(shù)塊，予2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水，純環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h，包埋聚合后超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色10 min，H-7500型透射電鏡（日本HITACH公司生產(chǎn)）觀察、拍照。

2 結果

2.1 血清Bun、Scr含量的改變 對照組和治療組大鼠血清Bun、Scr水平均隨著再灌注時間的延長而逐漸升高。對照組的BUN、Scr均于再灌注6 h后開始與假手術組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P<0.05或P<0.01）；治療組再灌注12 h的BUN（P<0.05）和再灌注6、12 h的Scr也顯著高于假手術組（P<0.05和P<0.01），但低于相應對照組（P<0.01），見表1。

表1 各組大鼠血清Bun、Scr含量的比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠血清Bun、Scr含量的比較（±s，n=6）

與假手術組比：*P<0.05，**P<0.01；與對照組比：△△P<0.01

組別假手術組IR1h組IR6h組IR12h組BUN(mmol·L-1)Scr(μmol·L-1)對照組9.9±1.5 10.6±2.1 15.2±3.5*22.7±5.9**治療組9.7±2.8 10.2±2.9 13.0±5.2 15.6±4.4*△△對照組36±16 49±8 75±15**112±18**治療組37±19 44±13 62±9*△△87±11**△△

2.2 腎皮質組織FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的改變隨著缺血再灌注時間的延長，腎組織中FFA含量逐漸升高，再灌注12 h后與相應假手術組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；鈉鉀ATP酶活力逐漸下降，再灌注6 h后與相應的假手術組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。治療組再灌注12 h后鈉鉀ATP酶活力顯著高于相應對照組（P<0.01)；而FFA含量較相應對照組下降（P<0.01)，見表2。

2.3 腎臟組織超微結構變化 假手術組腎小管上皮細胞胞漿中存在大量線粒體（箭頭），極少見變性空泡，無斷裂，嵴間隙清晰可見，色深，細胞核無明顯固縮，見圖1①。IR12h對照組腎小管上皮細胞線粒體數(shù)量明顯減少、腫脹，嵴模糊，大量空泡變性（箭頭），細胞核明顯固縮，見圖1②。IR12h治療組腎小管上皮細胞胞漿線粒體較豐富，部分腫脹（箭頭），少見空泡變性，嵴可見，細胞核輕微固縮，見圖1③。

表2 各組大鼠腎皮質FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠腎皮質FFA含量、鈉鉀ATP酶活力的比較（±s，n=6）

與假手術組比：*P<0.05，**P<0.01；與對照組比：△P<0.01

組別假手術組IR1h組IR6h組IR12h組FFA(μml·mg-1prot)對照組27.67±7.12 29.50±9.24 33.43±7.74 53.43±9.31**治療組23.85±5.11 28.87±6.54 30.12±9.03 41.95±4.60**△鈉鉀ATP酶活力（U·mg-1 prot）對照組0.985±0.273 0.916±0.33 0.549±0.166*0.394±0.092**治療組0.950±0.287 0.921±0.294 0.670±0.181**0.581±0.074**△

圖1 腎近曲小管上皮細胞超微機構（×17000）

3 討論

左卡尼汀是一種氨基酸衍生物，可由人體內源性產(chǎn)生或自肉類食品中攝取。它本身并非機體的基本營養(yǎng)素，而是脂肪酸進入線粒體進行β-氧化所必需的輔助因子，可加速轉運長鏈脂肪酸通過線粒體內膜，進入線粒體進行β氧化供能，與脂肪酸的利用及能量生成密切相關。因其對心肌缺血低氧的保護作用受到公認[6]，左卡尼汀在臨床上已開始應用于心肌梗死、中重度心力衰竭及體外循環(huán)手術患者。但關于其在RIRI中的作用，目前尚知之甚少。

因腎移植患者多為雙側腎功能嚴重衰竭，本實驗采用右腎切除，左腎單側缺血再灌注的RIRI模型，更貼近腎移植患者的臨床實際。結果顯示對照組大鼠血Bun、Scr明顯升高，且此改變隨再灌注時間的延長而更加明顯，提示大鼠的腎功能在再灌注后顯著受損；腎超微結構顯示腎小管上皮細胞腫脹，大量空泡變性，細胞核明顯固縮，以上表明本次RIRI造模成功。而應用左卡尼汀后IR6h、IR12h治療組大鼠血Bun、Scr較同時點對照組顯著下降，超微結構可見組織損傷也明顯減輕，說明左卡尼汀可改善腎功能，保護腎小管上皮細胞，從而減輕腎缺血再灌注損傷。

臟器缺血再灌注可從多個方面造成組織損傷，其中代謝受阻、能量不足是主要原因之一。缺血后，組織有氧氧化受阻，能量供應嚴重不足造成損傷，糖酵解的加速雖可提供ATP，但同時生成的大量酸性產(chǎn)物可誘發(fā)鈣超載，導致線粒體嚴重受損，進一步干擾能量代謝。腎臟血供豐富，占心輸出量的20%～25%；就單位重量而言，其氧耗僅次于心臟，機能活動極為旺盛，故能量代謝紊亂對RIRI的發(fā)生發(fā)展影響很大。Li等[7]報道RIRI時鈉鉀ATP酶活性受抑，可致細胞毒性水腫，線粒體、溶酶體膜破裂。脂肪酸為腎皮質的主要能源物質，特別是手術后或者急性腎損傷后，多種激素分泌增加可使體內糖原迅速分解，此時脂肪酸的供能作用更加重要。心肌缺血后，脂肪酸β-氧化的生理抑制劑丙二酰CoA水平下降，至再灌注30 min后達最低，導致缺血再灌注后脂肪酸的氧化迅速恢復且其氧化速率超過缺血前的水平[8]，提示脂肪酸氧化供能可能在缺血再灌注后的能量供應中占重要地位。此外，脂肪酸的氧化更是血管內皮細胞唯一的能量來源，而左卡尼汀又是脂肪酸氧化途徑中必不可少的輔助因子，因此左旋卡尼汀對血管內皮細胞有明顯的保護作用。早在20世紀90年代，Hulsmann等[9]的研究就指出，內皮細胞在缺血期易向外釋放卡尼汀，且細胞內剩余卡尼汀活性明顯下降，而進一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血前補充左旋卡尼汀可增加冠狀動脈的血流量，改善缺血后的心功能[10]。

本研究結果表明，對照組再灌注后FFA含量逐漸升高，鈉鉀ATP酶活力逐漸下降，與假手術組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），腎小管上皮細胞超微結構顯示線粒體數(shù)量明顯減少，結構損傷嚴重，提示RIRI后線粒體破壞明顯，F(xiàn)FA分解受阻堆積，能量生成障礙。應用左卡尼汀之后，F(xiàn)FA較對照組同時點明顯下降，鈉鉀ATP酶活力明顯升高，腎功能得到顯著改善，超微結構顯示線粒體數(shù)量增多，損傷減輕，表明左卡尼汀能有效保護腎功能，抑制腎缺血再灌注損傷，其機制可能與左卡汀促進FFA進行β-氧化，清除脂肪酸代謝的旁路產(chǎn)物及其他細胞內毒性[11]，保護線粒體結構，減輕內皮損傷有關。

[1]陳孝文,江黎明,葉鋒.急性腎功能衰竭[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:26.

[2]夏經(jīng)鋼,王麗娟,胡健.左卡尼汀對兔在心肌缺血/再灌注損傷狀態(tài)下抗氧化指標分析[J].中國醫(yī)科大學學報,2006,35(4):364-366.

[3]Turkyilmaz C, Turkyilmaz Z, Onal E, et a1.L-carnitine pretreatment reduces apoptotic cell death in seven-day-old rats hypoxia ischemia [J]. Restor Neurol Neurosci,2010,28(6):817-824.

[4]Takada M,Chandraker A,Nadeau KC,et a1.The role of the B7 costimulatory pathway in experimental cold ischemia/reperfusion injury[J].J Clin Invest,1997,100(5):1199-1203.

[5]Sener G,Paskaloglu K,Satiroglu H,et al. L-carnitine ameliorates oxidative damage due to chronic renal failure in rats[J].J Cardiovasc Pharmaccol,2004,43(5):698-705.

[6]Serati AR, Motamedi MR, Emami S, et a1.L-carnitine treatment in patients with mild diastolic heart failure is associated with improvement in diastolic function and symptoms[J]. Cardiology,2010,116(3):178-182.

[7]Li DB, Zhao CL, Lin HY, et a1. Effects of astragalus and angelica injections on adenosine triphosphate-ase in renal injury induced by ischemia/reperfusion in rabbits [J].Chin J Clin Rehabil,2005,9(15):222-224.

[8]Calvanim M , Reda E, Arrigoni-Martelli E.Regulation by carnitine of myocardial fatty acid and carbohydrate metabolism under normal and pathological conditions [J].Basic Res Cardiol,2000,95(2):75-83.

[9]Hulsmann WC, Dubelaar ML. Carnitine requirement of vascular endothelial and smooth muscle cells in imminent ischemia [J]. Mol Cell Biochem,1992,116(122):125-129.

[10]Gesuete V, Ragni L, Picchio FM, et al. The “big heart” of carnitine [J]. G Ital Cardiol (Rome),2010,11(9):703-705.

[11]Gorur S, Bagdatoglu OT, Polat G. Protective effect of L-carnitine on renal ischaemia-reperfusion injury in the rat[J]. Cell Biochen Funct,2005,23(3):151-155.