黃曉燕，高瞻，周希，梁萬(wàn)前，陳錫文，陳通克，楊德業(yè)（.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學(xué)院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州35000；.溫州醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 35035）

先天性心臟病-室間隔缺損（ventricular septum defect，VSD）是常見的心血管疾病，但我們對(duì)其致病因素及發(fā)病機(jī)制卻仍知之甚少。骨形態(tài)形成蛋白受體IA（bone morphogenetic protein receptor type 1A，又名ALK3）在心臟發(fā)育及室間隔形成中發(fā)揮重要作用[1-2]。已有心臟特異性ALK3基因敲除的小鼠模型培育成功[3]。ALK3基因敲除純合子小鼠胚胎發(fā)育皆終止于中期，并伴室間隔缺損、心內(nèi)膜墊和肌小梁發(fā)育不全[4]、心肌細(xì)胞凋亡增加[5]。在ALK3基因缺失造成心臟發(fā)育異常的具體通路的實(shí)驗(yàn)研究中，楊德業(yè)教授的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子paired box gene 8（Pax-8）在ALK3基因敲除的純合子小鼠胚胎心臟中下調(diào)了7.1倍[6-8]。Pax-8參與心臟的正常發(fā)育，并與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)[9]，Pax-8表達(dá)下調(diào)時(shí)細(xì)胞凋亡顯著增加，細(xì)胞增殖活性下降[10]。

為了探討Pax-8基因下調(diào)后引起細(xì)胞凋亡增多的機(jī)制，基因芯片和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)被應(yīng)用于篩選Pax-8基因敲除小鼠差異表達(dá)的下游基因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Pax-8基因敲除小鼠模型由德國(guó)Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈(zèng)。Pax-8基因敲除小鼠純合子（Pax-8 KO-/-）為實(shí)驗(yàn)組，Pax-8基因敲除小鼠雜合子（Pax-8 KO+/-）和野生型（Pax-8 KO+/+）為對(duì)照組。純合子和雜合子小鼠由雌性Pax-8 KO+/-小鼠與雄性Pax-8 KO+/-小鼠交配所得。

1.2方法

1.2.1 Pax-8基因敲除小鼠的基因型鑒定：實(shí)驗(yàn)小鼠基因型由PCR法鑒定。引物為5’-GGATGTGGAA TGTGTGCGAGG-3’、5’-GCTAAGAGAAGGTGGATGAGAG-3’，和5’-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3’。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過(guò)10個(gè)循環(huán)后，再94 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。每組擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL，用含Gold View的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)（quantity one）攝像分析。

1.2.2 芯片雜交：取Pax-8 KO-/-組與Pax-8 KO+/-組出生第1天（P0）小鼠各3只，心臟組織總RNA由TRIzol法常規(guī)提取，經(jīng)紫外吸收測(cè)定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。按上海生物芯片有限公司試劑盒說(shuō)明書操作，反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化。Cy3-dUTP標(biāo)記Pax-8 KO-/-cDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記Pax-8 KO+/-cDNA，將含31802個(gè)小鼠基因的Mouse OneArrayTMWhole Genome DNA microarray芯片（購(gòu)自臺(tái)灣華聯(lián)芯片）與探針雜交（按臺(tái)灣華聯(lián)芯片說(shuō)明書操作）。結(jié)果采用Axon公司的Gene Pix4100掃描，Gene PixPro4.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。用管家基因進(jìn)行Cy3和Cy5均衡。判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為：①Cy3和Cy5信號(hào)比值>2.0為表達(dá)上調(diào)，<0.5為表達(dá)下調(diào)，0.5～2.0為不存在顯著表達(dá)差異。②Cy3和Cy5信號(hào)比值其中之一必須>200或其中之一<800及Cy5/Cy3在0.1～10之間，作為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 半定量RT-PCR：Pax-8 KO-/-組、Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO+/+組各取P0小鼠3只，心臟組織總RNA由TRIzol法提取。經(jīng)紫外吸收測(cè)定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量后，取2μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit RT試劑盒說(shuō)明書操作）。每組各取0.3μg cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增NR4A1和GAPDH片段。NR4A1上游引物為5’-ATGCGATTCTGCAGCTCTTCC-3’，下游引物為5’-GGGTGGTATTGTCGTAGTAGAAGG-3’，GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’（均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）。管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化NR4A1 mRNA表達(dá)。NR4A1反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，56.4℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。GAPDH反應(yīng)條件如下: 94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，54.6℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。分別當(dāng)24、28、32、36個(gè)循環(huán)時(shí)中止反應(yīng)，取5μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)（quantity one）攝像分析。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR：Pax-8 KO-/-組、Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO+/+組各取P0小鼠3只，如上述方法獲得cDNA后，用NR4A1實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物（由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。NR4A1引物序列為上游：5’-TGTTG ATGTTCCCGCCTTTG-3’，下游：5’-ATGCGATTCTGCAGC TCTTCC-3’（由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），采用Beta-actin作為內(nèi)部參照。用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過(guò)比較ΔCt的方法進(jìn)行NR4A1表達(dá)的定量分析，NR4A1的相對(duì)表達(dá)量用2－ΔCt表示。Ct為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt為NR4A1 Ct值與內(nèi)參Beta-actin Ct值之差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 11.5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 PCR法鑒定Pax-8基因敲除小鼠基因型 Pax-8 KO-/-表現(xiàn)為約370 bp的單一條帶，Pax-8 KO+/+表現(xiàn)為約390 bp的單一條帶，Pax-8 KO+/-表現(xiàn)為390 bp和370 bp雙條帶（見圖1）。

圖1 PCR法鑒定Pax-8基因敲除小鼠的基因型

2.2 Pax-8基因敲除小鼠中差異表達(dá)的基因 通過(guò)基因芯片對(duì)31802個(gè)已知基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與Pax-8 KO+/-組相比，在Pax-8 KO-/-組中25個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，另外17個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其中涉及細(xì)胞周期、直接參與代謝、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及核轉(zhuǎn)錄因子的基因，部分差異表達(dá)的基因見表1。

表1 利用基因芯片獲得Pax-8 KO-/-的部分差異表達(dá)基因

2.3 半定量RT-PCR法驗(yàn)證基因芯片篩查結(jié)果 針對(duì)基因芯片篩選出的上調(diào)和下調(diào)的基因的引物做PCR擴(kuò)增，比較不同的擴(kuò)增周期不同基因的PCR產(chǎn)物量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR4A1的PCR產(chǎn)物在第28個(gè)PCR循環(huán)周期開始，Pax-8 KO-/-組明顯多于Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO+/+組。說(shuō)明NR4A1基因在Pax-8 KO-/-小鼠中表達(dá)上調(diào)（見圖2）。

圖2 在P0的Pax-8 KO-/-小鼠，Pax-8 KO+/-小鼠和Pax-8 KO+/+小鼠心臟中NR4A1和GAPDH基因在不同的PCR擴(kuò)增周期的產(chǎn)量比較

圖3 NR4A1基因定量RT-PCR結(jié)果

2.4 熒光定量RT-PCR結(jié)果 NR4A1在Pax-8 KO-/-組比Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO+/+組分別上調(diào)（1.53±0.08）倍和（4.80±0.35）倍（均P<0.01），而作為內(nèi)部對(duì)照的Beta-actin基因水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見圖3）。

3 討論

NR4A1，又稱為Nur77、TR3、NGFI-B等，是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族一員，從氨基端到羧基端，一共有4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（見圖4）。由于目前沒有發(fā)現(xiàn)NR4A1的配體，故他們又被稱為孤兒核受體。

圖4 NR4A1簡(jiǎn)圖

無(wú)論在以細(xì)胞增殖為主的腫瘤細(xì)胞中[11-12]，還是在以細(xì)胞凋亡為主的生物過(guò)程中[13-14]，都可以找到NR4A1高表達(dá)的證據(jù)，表明其在增殖和凋亡上存在雙重作用。目前研究表明，NR4A1在增殖和凋亡中的作用主要取決于細(xì)胞受到的分子信號(hào)：當(dāng)細(xì)胞受到促進(jìn)生長(zhǎng)分裂的分子信號(hào)如Erk2等刺激時(shí)，NR4A1可作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)[15]；當(dāng)細(xì)胞受到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子信號(hào)如JNK[16]等刺激時(shí)，NR4A1通過(guò)磷酸化，與RXR（retinoid X receptor）形成二聚體，從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至線粒體，與Bcl-2蛋白結(jié)合。NR4A1能與Bcl-2的第三和第四個(gè)同源結(jié)構(gòu)域-BH3、BH4之間的環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而使BH3暴露，使Bcl-2從保護(hù)凋亡轉(zhuǎn)為促進(jìn)凋亡，觸發(fā)細(xì)胞色素C釋放，激活細(xì)胞凋亡[17]。

值得注意的是，在Pax-8基因敲除小鼠心臟中，同時(shí)存在較正常高表達(dá)的NR4A1與Bcl-2-like 14（Bcl2l14）基因[18]。而后者的激活形態(tài)只含有BH3一個(gè)結(jié)構(gòu)域，能夠顯著促進(jìn)凋亡。

在整個(gè)室間隔形成的過(guò)程中，包括在房室心內(nèi)膜墊、間隔、流出道、肌小梁和乳頭肌的發(fā)生中，細(xì)胞凋亡都扮演著關(guān)鍵角色[19-21]。在Pax-8基因敲除小鼠心臟中，可能存在由NR4A1介導(dǎo)的，通過(guò)Bcl2l14執(zhí)行的細(xì)胞凋亡增加。使得在心臟室間隔發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡過(guò)度，室間隔形成緩慢甚至室間隔缺損——這是我們從本研究中得出的推測(cè)，然而需要確證這種假設(shè)還需要進(jìn)行NR4A1細(xì)胞內(nèi)定位，NR4A1干擾后觀察Bcl2l14表達(dá)變化等實(shí)驗(yàn)。

致謝：此課題的完成得到德國(guó)Peter Gruss及Ahmed Mansouri教授的支持和幫助，尤其是惠贈(zèng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，特此表示感謝！

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