沈 峰 潘海濤 麻 松 曾 崢

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院骨科，北京 100050)

臨床工作中醫(yī)師發(fā)現(xiàn)，當(dāng)四肢骨折伴隨腦損傷時(shí)，骨折處往往可見骨痂過度生長，骨折愈合明顯快于單純的四肢骨折，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化。盡管臨床和實(shí)驗(yàn)研究［1-3］均支持中樞神經(jīng)損傷促進(jìn)骨折愈合的結(jié)論，但其作用機(jī)制仍未明確。1990年Bidner S M等［4］研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后其血清促骨生長活性增加。從此，體液因素引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者也設(shè)計(jì)了大量動物模型實(shí)驗(yàn)［5-7］，對體液因素中各種生長因子對于腦外傷合并骨折時(shí)促進(jìn)骨折愈合的可能機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得了重要進(jìn)展。目前國內(nèi)外有關(guān)腦外傷合并骨折病人體液因素及激素水平與骨折愈合關(guān)系的相關(guān)報(bào)道甚少。

本文作者通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫組織化學(xué)染色，觀察骨折合并腦損傷時(shí)人體血清中血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)含量的變化與骨折位點(diǎn)VEGF表達(dá)的關(guān)系，探討腦損傷合并骨折時(shí)骨折愈合加速的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用VEGF等相關(guān)因子治療難愈合性骨折提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2008年10月至2010年11月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院骨科及病理科完成。Olympus顯微鏡、攝影鏡、病理圖像分析系統(tǒng)由北京天壇醫(yī)院病理科提供;VEGF多克隆抗體、PV-6000即用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)。VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒由北京嘉美諾斯生物科技有限公司提供。酶標(biāo)讀板儀(Humanreader，德國)由北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 一般資料

本研究26例腦外傷合并骨折患者及31例單純骨折患者均來自于2008年10月至2010年11月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科及骨科住院的患者。57例患者中男36例，女21例，男女比例約為1.7∶1;年齡14 ～62 歲，平均年齡 36.7 歲;手術(shù)距受傷時(shí)間3～22 d，平均13.2 d。所有患者骨折部位與類型基本相同，均為四肢長管狀骨骨折，腦外傷合并骨折患者均有影像學(xué)證實(shí)存在顱腦外傷，Glasgow評分5～12分，全部病例無其他神經(jīng)系統(tǒng)及心、肝、腎嚴(yán)重疾患，無血液病，無糖尿病、無骨質(zhì)疏松及成骨不全。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會，所有患者已簽署知情同意書。

1.3 方法

1)ELISA法

(1)研究對象分組:將57例患者分成2組，即:單純骨折組(A組、對照組)31例和骨折合并腦外傷組(B組、實(shí)驗(yàn)組)26例。

(2)標(biāo)本采集和處理:所有病例均在傷后1、2、3、4周時(shí)取空腹靜脈血2 mL，血液離心后取血清，置于-70℃保存待檢。

(3)血清VEGF濃度測定:每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL于空白微孔中，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃孵育反應(yīng)120 min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每次靜置10～20 s，向?yàn)V紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃孵育反應(yīng)60 min，洗板機(jī)清洗4～6次，每次靜置10～20 s，向?yàn)V紙上印干。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置37℃孵育反應(yīng)30 min，洗板機(jī)清洗4～6次，每次靜置10～20 s，向?yàn)V紙上印干。每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應(yīng)15 min，每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的濃度值。

2)免疫組織化學(xué)染色法

(1)研究對象分組:根據(jù)手術(shù)距受傷時(shí)間3～7 d、8～14 d、15～21 d，分別將31例單純骨折組(A組、對照組)和26例骨折合并腦外傷組(B組、實(shí)驗(yàn)組)分為A1(10例)、A2(11例)、A3(10例)組和 B1(8例)、B2(8例)、B3(10例)組。

(2)標(biāo)本采集和處理:術(shù)中切取骨折局部新鮮肉芽組織，經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片。

(3)免疫組織化學(xué)染色:①肉芽組織切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。② 高壓修復(fù)抗原。③分別經(jīng)3%H2O2室溫孵育5 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，50 mL/L山羊血清封閉非特異性抗原。④滴加第一抗體(VEGF多克隆抗體，工作濃度1∶100)處理，4℃過夜，PBS沖洗，2 min×3次。⑤ 滴加試劑1(polymer helper)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑥ 滴加試劑2(poly peroxidase-antimouse/rabbit IgG)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑦ DAB顯色。⑧ 蒸餾水充分沖洗，復(fù)染。⑨脫水透明、封片。

(4)免疫組化圖像分析:用陽性細(xì)胞表達(dá)率和目標(biāo)灰度值進(jìn)行量化。標(biāo)本切片置于光鏡下輸入并顯示圖像，每個(gè)切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，在同一光強(qiáng)度下進(jìn)行陽性細(xì)胞表達(dá)率和灰度值測算。陽性細(xì)胞表達(dá)率越大，抗體表達(dá)越多;灰度值表示陽性細(xì)胞內(nèi)信號的強(qiáng)度，灰度值越小則信號越強(qiáng)，抗體濃度越大。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。2組數(shù)據(jù)比較分別應(yīng)用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF含量比較

A組(單純骨折組)患者血清VEGF含量在傷后2周出現(xiàn)峰值，較B組(腦外傷合并骨折組)高峰出現(xiàn)晚，峰值低，持續(xù)時(shí)間短。在4周時(shí)有明顯下降;B組(腦外傷合并骨折組)患者血清VEGF含量在傷后1周即出現(xiàn)高峰，較A組(單純骨折組)高峰出現(xiàn)早，峰值高，以后雖有所下降但仍維持較高水平，持續(xù)時(shí)間長，在4周時(shí)有明顯下降。傷后1、2、3周時(shí)，2組患者血清VEGF含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，4周時(shí)2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見表1。時(shí)間主效應(yīng)的F=14.796，P＜0.01，說明各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清VEGF含量有差異;腦外傷主效應(yīng)的F=12.477，P＜0.01，說明2組間血清 VEGF 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 A、B組血清VEGF含量Tab.1Level of serum VEGF of group A and B(±s)(pg/mL)

表1 A、B組血清VEGF含量Tab.1Level of serum VEGF of group A and B(±s)(pg/mL)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group Number of case 1 week 2 week 3 week 4 week A 31 12.98 ±6.30 20.08 ±9.76 16.27 ±8.65 13.41 ±7.85 B 26 27.89 ±12.74 26.31 ±11.14 22.48 ±9.97 14.84 ±6.27 F 32.939 5.070 6.346 0.590 P 0.020 0.012 0.446 0

2.2 2組患者不同時(shí)間段VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較(陽性表達(dá)均呈棕黃色顆粒)

1)鏡下觀察:A組(單純骨折組)3～7 d在肉芽組織中的成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞質(zhì)中均有少量VEGF陽性表達(dá)(圖1A)。8～14 d主要在間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞表達(dá)陽性(圖1B)。15～21 d主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞表達(dá)陽性(圖1C);B組(腦外傷合并骨折組)3～7 d在肉芽組織中的成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、早期軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞胞質(zhì)中均有廣泛的VEGF陽性表達(dá)(圖1D)。8～14 d主要在間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞表達(dá)陽性(圖1E)。15～21 d主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞表達(dá)陽性(圖1F)。

2)免疫組織化學(xué)染色VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)率:A組(單純骨折組)3～7 d時(shí)VEGF有少量表達(dá)，隨后逐漸升高，在14 d左右達(dá)高峰，在15～21 d時(shí)略下降。B組(腦外傷合并骨折組)在受傷后3 d時(shí)VEGF即有大量表達(dá)，在受傷后7 d達(dá)高峰，在15～21 d時(shí)仍維持在較高水平。B組(腦外傷合并骨折組)在各時(shí)間段，VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞率及灰度值均顯著高于A組(單純骨折組)(P＜0.05)，詳見表2，3。

3 討論

圖1 單純骨折組與腦外傷合并骨折組VEGF免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of VEGF for fracture group and fracture with cerebral trauma group(200×)

表2 A組、B組肉芽組織VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)率Tab.2 The positive expression rate of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

表2 A組、B組肉芽組織VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)率Tab.2 The positive expression rate of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group 3～7 d 8～14 d 15～21 d A 47.3 ±7.5(n=10) 68.4 ±8.3(n=11) 52.1 ±10.2(n=10)B 89.2 ±9.7(n=8) 83.6 ±9.0(n=8) 77.2 ±9.3(n=10)t 2.826 2.436 2.574 P 0.008 0.015 0

大量臨床病例研究表明，骨折患者若同時(shí)伴有腦外傷，其骨折愈合過程明顯加快，甚至在未見骨折的某些關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)異位骨化現(xiàn)象。早在1968年，F(xiàn)eeneyDM等［8］首次報(bào)告腦外傷后出現(xiàn)異位骨化現(xiàn)象，后許多學(xué)者對骨折合并腦外傷患者的骨愈合和異位骨化進(jìn)行了研究。Spencer R F［9］比較了53例合并腦外傷的長骨骨折患者與無腦外傷骨折患者的骨折愈合情況，并對骨痂形成量進(jìn)行量化，得出了相同結(jié)論。關(guān)于腦外傷后加速骨折愈合的調(diào)節(jié)因素，國內(nèi)外學(xué)者［10-14］已開始在分子生物學(xué)水平進(jìn)行研究，并逐漸認(rèn)識到細(xì)胞因子的特殊作用。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)［5-7，11-14］已證實(shí)，VEGF、TGF-β1、bFGF、PDGF、IGF-1 等生長因子均有較強(qiáng)的促進(jìn)骨折愈合的作用，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示腦外傷后這些生長因子表達(dá)水平升高可能是骨折愈合加速的原因之一。

表3 A組、B組肉芽組織VEGF平均灰度值Tab.3 The gray scale value of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

表3 A組、B組肉芽組織VEGF平均灰度值Tab.3 The gray scale value of VEGF in granulation tissue of group A and B(±s)(%)

Group A:group of fracture;Group B:fracture with cerebral trauma group VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group 3～7 d 8～14 d 15～21 d A 129.43 ±16.84 117.26 ±11.26 122.29 ±13.28 B 102.52 ±10.56 107.43 ±9.77 113.37 ±10.79 t 2.717 2.267 2.686 P 0.001 0.012 0.010

骨折的愈合主要有2種方式:膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨，這是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，大量細(xì)胞因子在不同的骨折修復(fù)階段發(fā)揮不同的作用。血管生成在骨折愈合過程中具有重要意義。新的血管形成可能與諸多因素有關(guān)，其中VEGF具有促進(jìn)血管生成、維持血管功能以及增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用，故尤為重要。

本研究ELISA實(shí)驗(yàn)中，患者血清VEGF濃度在A、B 2組均發(fā)生改變，且均有峰值，并持續(xù)一段時(shí)間，后逐漸降低。A組(單純骨折組)患者血清VEGF含量在傷后1周含量較少，2周出現(xiàn)峰值，在4周時(shí)有明顯下降，這與武永剛等［15］的研究結(jié)果相符。他們發(fā)現(xiàn)在骨折愈合的不同階段，骨痂中VEGF基因表達(dá)的程度不同。他們認(rèn)為骨折后早期 (5～7 d)骨折局部由于出血、組織細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞反應(yīng)引起了血流中斷、此時(shí)的VEGF表達(dá)量較弱。隨著骨折的修復(fù)，肉芽組織的增長加快使得血供相對減少，氧分壓降低，低氧強(qiáng)烈誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。大約在骨折后2周VEGF mRNA表達(dá)量達(dá)到高峰，約為初期的2.4倍。此時(shí)恰為軟骨細(xì)胞合成高峰期，軟骨痂內(nèi)迅速形成的新生血管有助于提供前骨祖細(xì)胞。而在骨修復(fù)的后期，VEGF mRNA的表達(dá)呈平穩(wěn)下滑趨勢。本研究免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)A、B 2組患者骨折局部肉芽組織中均可見新生血管，且新生血管壁可見大量VEGF棕黃色陽性表達(dá)顆粒，表明VEGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成的作用。這一作用的結(jié)果是為骨折局部帶來了更多的氧，極大地改善了骨折局部的缺氧狀態(tài);為骨折局部更多組織的修復(fù)提供營養(yǎng)，運(yùn)送足量鈣質(zhì)，促進(jìn)骨痂形成;為骨折局部帶來更多炎性細(xì)胞，其趨化作用使更多細(xì)胞因子聚集到骨折局部，為各種生長因子發(fā)揮“網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)”作用創(chuàng)造了條件，共同促進(jìn)細(xì)胞移行、增生、分化，修復(fù)損傷的組織;還可將大量間充質(zhì)細(xì)胞帶入損傷區(qū)，間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞。通過切片觀察，我們可以看到VEGF在B組(腦外傷合并骨折組)患者肉芽組織的早期軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞胞質(zhì)中有廣泛的陽性表達(dá)。國外實(shí)驗(yàn)［16］發(fā)現(xiàn)，骨折部位的成骨細(xì)胞具有 VEGF-1和VEGF-2受體的表達(dá)，因此，VEGF可以直接作用于成骨細(xì)胞，并可以與之結(jié)合，增加其移行和分化功能，使堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，局部鈣鹽沉積，促進(jìn)骨折愈合，并且能夠加速軟骨的鈣化及骨組織的改建過程。另外，我們還可以看到在軟骨化骨生成區(qū)域，新生血管壁可見大量VEGF陽性表達(dá)顆粒，表明VEGF還可以誘導(dǎo)血管長入軟骨，從而使軟骨內(nèi)成骨增強(qiáng)，加速骨折愈合，這一結(jié)果與Hayami T等［17］通過實(shí)驗(yàn)得出的VEGF誘導(dǎo)血管長入軟骨的結(jié)論相似。故我們可以認(rèn)為VEGF可能在骨生長、骨改建和骨愈合過程中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)患者血清VEGF含量B組(腦外傷合并骨折組)在1～3周時(shí)均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的A組(單純骨折組)(P＜0.05)，峰值提前1周，且峰值持續(xù)時(shí)間較長;通過比較A、B 2組受傷后3～7 d、8～14 d、15～21 d各個(gè)時(shí)間段的VEGF陽性細(xì)胞率及灰度值，我們發(fā)現(xiàn)B組(腦外傷合并骨折組)VEGF表達(dá)持續(xù)高于A組(單純骨折組)，且表達(dá)高峰提前1周左右，表明在人體骨折愈合階段腦外傷這一因素對VEGF表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用，且表現(xiàn)在外周血(血清)和局部(骨折位點(diǎn))兩方面。鑒于VEGF具有強(qiáng)大的促進(jìn)血管生成作用，以及在骨愈合過程中的重要作用，我們推測腦外傷加速骨折愈合的作用可能是通過腦外傷促進(jìn)VEGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，并且其他生長因子的促血管生成作用是以其為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的。目前認(rèn)為多種生物因子和缺氧為導(dǎo)致VEGF表達(dá)的常見因素。VEGF的表達(dá)依賴于一些細(xì)胞因子和骨折局部的微環(huán)境，比如，方海軍等［18］發(fā)現(xiàn) TGF-β1對 VEGF具有促進(jìn)和抑制雙向調(diào)節(jié)作用;張忠提等［19］發(fā)現(xiàn)外源性bFGF能夠刺激VEGF分泌，bFGF與VEGF有明顯的時(shí)間和濃度關(guān)系，bFGF可以直接和間接地調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。而黃書嵐等［20］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦外傷后VEGF在患者腦組織中呈陽性表達(dá)，顯著高于正常腦組織，成骨細(xì)胞在缺氧刺激下，其VEGF mRNA及蛋白表達(dá)明顯提高，而且VEGF的表達(dá)與缺氧呈劑量依賴關(guān)系。國外學(xué)者［21］也對顱腦損傷后VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了VEGF在創(chuàng)傷性腦組織中的陽性表達(dá)，并且VEGF一般在腦缺血后3～8 h開始表達(dá)，1～2 d后達(dá)最高峰，而顱腦外傷后繼發(fā)性病理損害引起的腦組織缺血缺氧正處在這個(gè)時(shí)期，故腦外傷后缺血狀態(tài)是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的主要原因，VEGF已被證實(shí)是缺氧誘導(dǎo)生長的因子［22］。故我們推測腦外傷合并骨折患者血清中VEGF濃度增高，從而加速骨折愈合的可能原因?yàn)?腦外傷后繼發(fā)性病理損害引起的腦組織缺血缺氧，誘導(dǎo)腦挫傷灶周圍腦組織VEGF基因表達(dá)增高，血液、腦脊液中VEGF濃度升高，通過腦外傷后破壞的血-腦脊液屏障入血，使外周血中VEGF含量增加;受損腦組織直接釋放促有絲分裂活性物質(zhì)或生長因子(PDGF、TGF-β1、bFGF、IGF-1等)進(jìn)入血液循環(huán)，調(diào)節(jié)、刺激和促進(jìn)外周血中VEGF的含量增加。腦外傷合并骨折患者骨折局部中VEGF表達(dá)增加，從而加速骨折愈合的可能原因?yàn)?血清中濃度升高的VEGF，通過外周血液循環(huán)到達(dá)骨折局部;腦外傷后抑制或消耗皮質(zhì)類固醇等抗炎物質(zhì)的活動，使骨折出血增加，組織缺氧增加，刺激VEGF增加;腦外傷后血清中生長因子含量發(fā)生變化，而這些因子隨著血循環(huán)到達(dá)骨折位點(diǎn)，可以促進(jìn)VEGF以及多種細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合;腦外傷后中樞系統(tǒng)對周圍神經(jīng)抑制減弱，從而使骨折處骨痂內(nèi)感覺神經(jīng)釋放神經(jīng)生長因子，而神經(jīng)生長因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，可促進(jìn)血管內(nèi)皮增生，刺激產(chǎn)生VEGF。當(dāng)然VEGF只是多種生長因子網(wǎng)絡(luò)中的一員，而各種生長因子間存在相互聯(lián)系、相互制約的關(guān)系，組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控腦外傷加速骨折愈合的過程，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，有多種生長因子參與，并起重要作用，臨床上可以見到一些難治性骨折，如老年人骨折、股骨頸骨折，脛骨中下段骨折等，這些骨折往往由于血供很差，難以愈合。本實(shí)驗(yàn)研究對臨床促進(jìn)骨折愈合，治療骨折不愈合或延遲愈合有一定的意義。隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，各種生長因子將逐漸應(yīng)用于臨床，Lattermann C等［23］在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在骨折部位應(yīng)用VEGF腺病毒轉(zhuǎn)染的方法可促進(jìn)骨折愈合，提示在不遠(yuǎn)的將來，VEGF等相關(guān)因子治療難治性骨折將成為可能。

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