劉 潔 王 泳 武連華 高春錦*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院高壓氧科，北京 100038;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院高壓氧科，北京 100020)

人們由低海拔地區(qū)進入高原地帶，由于環(huán)境氧分壓的變化造成組織器官缺氧，因為適應(yīng)不全產(chǎn)生的不適和器質(zhì)性病變統(tǒng)稱為急性高原病(acute mountain sickness，AMS)。由于急性高原病具有高發(fā)病率及高病死率的特點，預(yù)防高原病、提高高原低氧耐受能力已成為日益緊迫的問題。

本實驗旨在觀察在不同海拔高度缺氧腦損傷因子白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性的變化及高壓氧預(yù)處理對其影響，為高壓氧預(yù)治療提高機體低氧耐受能力預(yù)防高原病提供理論依據(jù)。本試驗得出的結(jié)果將在降低急性高原病發(fā)生率方面提供有益參考，其經(jīng)濟效益和社會效益相當(dāng)可觀。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

40只3月齡Wistar小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220～250g〔動物許可證號:SCXK(京)2002-0006〕，購自中國科學(xué)院遺傳發(fā)育研究所動物中心，于標準動物實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為15℃，相對濕度10%，標準鼠飼料及純凈水喂養(yǎng)。

采用抽簽法將40只小鼠隨機分為3大組:空白對照組(control group)8只，不進行預(yù)處理及模擬高原病處理;3 000 m高原組16只、5 000 m高原組16只，分別分2組進行高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)及常壓常氧(normal pressure oxygen，NPO)預(yù)處理，24 h后進行模擬高原病處理。分組為3 000 m HBO組8只，3 000 m NPO組8只，5 000 m HBO組8只，5 000 m NPO組8只。

1.2 高壓氧預(yù)處理

使用動物用純氧艙，首先純氧洗艙10 min，使艙內(nèi)氧濃度＞90%，放入動物10 min勻速升壓(氧流量約12 L/min)至2ATA，穩(wěn)壓吸氧45 min(其間用純氧通風(fēng)10 min，控制氧濃度大于95%)后，20 min勻速降壓(氧流量約7 L/min)至常壓。每日1次，連續(xù)處理3 d。

1.3 常壓常氧預(yù)處理

動物置于相同動物用純氧艙內(nèi)，使用空氣通風(fēng)但不加壓，時間為75 min，每日1次，連續(xù)處理3 d。

1.4 急性高原病模型建立

使用醫(yī)用低壓艙建立動物模型，高原組動物在進行預(yù)處理后24 h分別置于醫(yī)用低壓艙內(nèi)模擬海拔3 000 m及5 000 m低壓缺氧環(huán)境(PB分別為81.2 kPa及67.8 kPa)，暴露24 h。為避免動物急性升壓和降壓反應(yīng)，減壓速度控制于10 m/s，艙內(nèi)壓力勻速減至相應(yīng)壓力，艙內(nèi)溫度控制在22℃ ～28℃，濕度控制在50% ～60%。

1.5 標本收集

高原組小鼠在低壓艙內(nèi)暴露24 h后，由試驗操作者在相應(yīng)低壓環(huán)境中迅速進行采血操作。使用0.3%異戊巴比妥溶液對小鼠進行腹腔麻醉(用量75 mg/kg)，暴露腹主動脈，使用醫(yī)用注射器抽取動脈血約5 mL。經(jīng)遞物筒將血樣傳出艙外，2 500 r/min離心10 min，取上清置于一次性冷凍管中保存于-20℃冰箱中。對照組標本在常壓常氧條件下以相同方法進行采集，血清標本共計40份。

1.6 IL-6及MMP-9含量測定

IL-6(試劑盒由北京諾詩生物技術(shù)公司提供)及MMP-9(試劑盒由美國R﹠D system公司提供)的檢測使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，結(jié)果IL-6以pg/mL、MMP-9以ng/mL表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 11.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間參數(shù)比較使用析因方差分析。各組與對照組比較使用t檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗動物血清中IL-6含量變化

3 000m及5 000 m HBO組及NPO組IL-6含量較空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，3 000 m及5 000 m HBO組IL-6含量較同高度NPO組略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。5 000 m HBO組及NPO組IL-6含量較3 000 m組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 不同預(yù)處理條件下模擬高原病小鼠血IL-6含量比較Tab.1 Comparison of IL-6 contents in blood of AMS mice under different pretreatment conditions (pg/mL)

2.2 各組實驗動物血清中MMP-9檢測結(jié)果

3 000m及5 000 m HBO組及NPO組MMP-9含量較空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，3 000 m及5 000 m HBO組 MMP-9含量較同高度NPO組略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。5 000 m HBO組及NPO組MMP-9含量較3 000 m組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 不同預(yù)處理條件下模擬高原病小鼠血基質(zhì)金屬蛋白酶-9含量比較Tab.2 Comparison of MMP-9 contents in AMS mice’s blood under different pretreatment conditions (ng/mL)

3 討論

目前對于高原病的預(yù)防方法不多，其中載氧適應(yīng)法由楊景義［1］在1983年首次應(yīng)用于臨床，已取得一定效果。高壓氧治療理論上可以提高機體氧含量，改善微循環(huán)，抑制內(nèi)皮損傷過程中某些物質(zhì)的活性，延緩高原反應(yīng)的發(fā)生。實踐中又有成功應(yīng)用載氧適應(yīng)預(yù)防高原反應(yīng)的先例，如張西洲等［2］報道在海拔3 700 m處的受試者，進入富氧室12 h后其心肺功能得到明顯改善;彭兆云等［3］通過高壓氧暴露誘導(dǎo)小鼠低氧耐受發(fā)現(xiàn)高壓氧暴露能產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)動物耐受低氧環(huán)境的效應(yīng)。這從側(cè)面證實了在進入高原前選擇合適的治療壓力及療程進行高壓氧治療預(yù)防急性高原病的可行性。

3.1 急性高原病動物模型的建立

急性高原病的發(fā)病需要特殊的高原低氧環(huán)境誘導(dǎo)，在平原地區(qū)建立動物模型存在一定困難。目前一般采用低壓艙減壓模擬低壓缺氧環(huán)境制作動物模型。陳有等［4］利用低壓氧艙減壓模擬高原環(huán)境，得出大鼠在復(fù)合缺氧寒冷運動時可以誘發(fā)高原肺水腫的結(jié)論。王昊等［5］研究發(fā)現(xiàn)利用低壓艙模擬5 000 m高度，低壓缺氧暴露5 h可成功制成血-腦脊液屏障通透性改變模型。楊曉文等［6］也通過低壓艙成功制成大鼠高原反應(yīng)腦病理模型，并在暴露24 h后發(fā)現(xiàn)光鏡下硝酸鑭漏出血管腔等病理改變。本實驗選取24 h作為動物模型暴露時間符合高原腦水腫發(fā)生時間，實驗數(shù)據(jù)表明模型組血IL-6及MMP-9較對照組明顯升高，且隨著高度增加，IL-6及MMP-9的質(zhì)量濃度增加，證明模型組動物出現(xiàn)明顯缺氧腦損傷，結(jié)合動物在低壓低氧暴露過程中精神萎靡、活動量短暫增加后明顯減少，可以初步證明模型組動物已出現(xiàn)急性高原病。

3.2 高壓氧治療對模型小鼠血中IL-6及MMP-9含量變化的影響

IL-6通過促進炎性反應(yīng)而在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦組織損傷中起重要作用。IL-6作為一種重要的炎性反應(yīng)介質(zhì)其機制可能是調(diào)節(jié)成熟中性粒細胞的功能，促進其浸潤及聚集，抑制其凋亡［7］。動物實驗［8］發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈閉塞12 h后MMP-9活性顯著增高，在24 h達到高峰并持續(xù)5 d左右，給予抗MMP-9抗體可以有效縮小梗死灶體積。Asahi M等［9］發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血模型中，MMP-9在腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄及表達明顯增高，MMP-9基因敲除鼠的梗死灶體積較對照組明顯減小。MMP-9的過度表達通過破壞腦血管基底膜，從而在血-腦脊液屏障破壞、腦水腫形成及繼發(fā)性腦損傷及腦出血過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［10］。綜上所述，IL-6參與低壓缺氧環(huán)境中組織炎性反應(yīng)損傷，MMP-9參與毛細血管通透性改變，二者均在急性低壓缺氧損傷中起重要作用，故IL-6及MMP-9可以作為衡量缺氧腦損傷的指標。

高壓氧對血管內(nèi)皮細胞有明顯的作用。Sheikh A Y等［11］研究發(fā)現(xiàn)高壓氧可明顯增加血管內(nèi)皮細胞生長因子的濃度，影響內(nèi)皮細胞的功能及內(nèi)皮細胞纖維蛋白原的降解反應(yīng)。高壓氧治療對血管內(nèi)皮細胞的作用能減輕內(nèi)皮損傷，減少白細胞黏附，從而中斷炎性反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)效應(yīng)，減少IL-6等細胞因子的表達。唐杭軍等［12］對130例急性腦梗死患者分別進行常規(guī)治療與高壓氧及常規(guī)治療，結(jié)果2組治療后HBO組IL-6下降水平更低，這說明HBO治療在腦梗死急性期更能快速降低IL-6，快速減輕腦梗死后繼發(fā)的炎性反應(yīng)。故高壓氧治療可降低體內(nèi)IL-6含量，減少腦組織缺氧損傷，這與本實驗所得結(jié)果相符。

小膠質(zhì)細胞在缺血早期參與缺血性神經(jīng)元的損害過程，近年來人們發(fā)現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細胞可刺激MMP-9分泌。潘玨等［13］所做高壓氧對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷小膠質(zhì)細胞的影響研究表明，高壓氧治療早期抑制小膠質(zhì)細胞活化，缺血48 h后抑制MMP-9蛋白表達。故高壓氧治療可降低體內(nèi)MMP-9含量，減少腦組織缺氧損傷，這與本實驗所得結(jié)果相符。

綜上所述，可以得出高壓氧治療可以使體內(nèi)對于缺氧腦損傷敏感的IL-6及MMP-9 2因子含量降低，使腦組織缺氧損傷程度減輕。

3.3 高壓氧預(yù)處理對低氧耐受的影響

既往研究［14］證明高壓氧預(yù)處理可誘導(dǎo)沙土鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞對腦缺血產(chǎn)生耐受。由此可以佐證高壓氧預(yù)處理可通過增加氧儲備促使對低氧產(chǎn)生耐受，減輕細胞損傷和炎性細胞因子的釋放。李長春等［15］發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理可抑制活化的小膠質(zhì)細胞分泌細胞因子，從而改變了腦部的炎性反應(yīng)進程。高壓氧預(yù)處理具有:① 增加氧儲備促使機體細胞對低氧產(chǎn)生耐受，減輕細胞損傷和炎性細胞因子的釋放;②對血管內(nèi)皮細胞的作用能保護內(nèi)皮，減少白細胞黏附，從而中斷炎性反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)效應(yīng);③ 抑制活化的小膠質(zhì)細胞分泌細胞因子等重要作用。這些作用會使IL-6及MMP-9在缺氧損傷早期含量下降，減少炎性反應(yīng)對組織的繼發(fā)性損害。這正與本實驗得出高壓氧預(yù)處理組較對照組IL-6及MMP-9含量降低的結(jié)果相符，說明高壓氧預(yù)處理對減少腦缺氧損傷有意義。但本試驗尚未得出在2ATA、治療時間升壓10 min-穩(wěn)壓吸氧45 min-減壓20 min、療程1次×3 d的高壓氧預(yù)處理條件下IL-6及MMP-9兩因子的質(zhì)量濃度在模擬不同海拔高度時顯著性降低，故此種高壓氧預(yù)處理方案可能對急性高原病無明確預(yù)防作用。這說明對于有效的預(yù)防急性高原病的高壓氧治療方案還需進一步摸索。

［1］楊景義.高海拔地區(qū)(＞4 800米)載氧適應(yīng)對預(yù)防急性高原病意義的初步探討(附268例次載氧適應(yīng)調(diào)查報告)［J］.青海醫(yī)藥雜志，1986(6):10.

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